吴廷瑞，魏波

(广东医科大学附属医院骨科中心，广东 湛江 524001)

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于长骨的干骺端，以股骨远端和胫骨近端最为常见[1]。据报道，骨肉瘤的年发病率为(1～4)/100万，且男性发病率略高于女性[2]。生长迅速和早转移是骨肉瘤预后差的主要因素[3-5]。目前，手术与新辅助化疗药物的联合应用已成为临床绝大部分骨肉瘤患者的标准治疗策略，患者的生存率(60%～70%)也显著提高[6-7]。但仍有许多骨肉瘤患者对化疗药物不敏感或产生耐药性，且肿瘤的复发和广泛转移也严重影响患者的临床疗效和远期生存率。虽然骨肉瘤相关的分子生物学研究为其发病机制提供了一定理论依据，但有关骨肉瘤增殖凋亡、侵袭转移以及化学耐药性的分子机制仍未明确。随着新一代测序技术的发展，非编码RNA逐渐成为研究热点。研究认为，至少有90%的人类基因组转录成RNA，但其中只有约2%的基因转录并翻译合成蛋白质；不编码蛋白质的RNA曾被认为是转录过程中的“垃圾”序列，被定义为非编码RNA，包括微RNA(microRNA，miRNA)、环状RNA和长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)[8-9]。研究发现，多种lncRNA的异常表达与骨肉瘤的增殖、凋亡、迁移、侵袭等恶性生物学行为有密切联系；同时，部分lncRNA在骨肉瘤诊疗与预后中扮演肿瘤生物标志物的角色[10]。现就骨肉瘤相关lncRNA的研究进展予以综述。

1 lncRNA概述

lncRNA是一类定位于细胞核或细胞质中、长度>200 nt且不具有开放阅读编码区的RNA序列分子。目前lncRNA的来源尚未明确，但普遍认为可能有5个来源途径：①编码蛋白质序列的开放阅读编码区获得结构性改变转化为lncRNA；②染色体重新排列，两个非转录片段并列产生具有多个外显子的lncRNA；③非编码基因逆转座复制形成功能性逆基因或非功能性逆假基因；④两个复制子串联引起非编码RNA内的相邻重复；⑤插入转座子形成lncRNA[11]。根据与邻近的具有蛋白质编码功能的基因片段的位置关系，lncRNA又可分为5类：①反义lncRNA；②正义lncRNA；③内含子lncRNA；④双向lncRNA；⑤基因间lncRNA[11-13]。研究发现，lncRNA既可参与染色体表观遗传学修饰或通过与转录因子的相互作用在转录水平调节靶基因，也可参与转录后信使RNA的修饰等多水平调控，从而发挥促癌或抑癌作用[10]。

2 lncRNA在骨肉瘤中的差异表达

许多lncRNA在骨肉瘤中异常表达，与骨肉瘤发生、发展中大量基因及转录水平的显著改变密切相关。Li等[14]通过微阵列芯片技术分析了9对人的骨肉瘤组织和对应的瘤旁组织样本，结果发现了25 733个lncRNA，其中403个lncRNA上调，798个lncRNA下调(≥2.0倍，P<0.05)；且通过生物信息学进一步分析存在差异表达的lncRNA，发现了34条与转录本上调相关的信号通路及32条与转录本下调相关的信号通路。Zhu等[15]通过lncRNA芯片对5对骨肉瘤和癌旁组织进行分析，同时筛选差异表达的lncRNA，结果发现65个lncRNA上调，13个lncRNA下调，随后从差异表达的lncRNA中选择5个上调和5个下调表达程度最显著的lncRNA，在20对骨肉瘤和瘤旁组织中进行进一步验证，结果发现lncRNA核仁小RNA宿主基因16(ENSG00000163597)在骨肉瘤中的表达水平最高；进一步研究表明，核仁小RNA宿主基因16(ENSG00000163597)可作为miR-205的内源海绵，上调锌指E盒锌指蛋白1的表达，显著增强骨肉瘤细胞的增殖能力。张浩萌等[16]通过对5对骨肉瘤组织和瘤旁组织进行高通量转录组学测序，筛选出差异表达的lncRNA，并验证了lncRNA纤维肉瘤癌基因同源物G-反义RNA1(antisense RNA1，AS1)在骨肉瘤细胞内高表达且具有促进细胞增殖的作用。Liu等[17]使用微阵列芯片技术分析了7对骨肉瘤与瘤旁组织中lncRNA的表达情况，结果显示1 995 个lncRNA上调，2 226个lncRNA下调(≥2.0倍，P<0.05)，其中特异AT序列结合蛋白2(special AT-rich sequence-binding protein 2，SATB2)的反义转录物SATB2-AS1是被上调的lncRNA之一，SATB2-AS1可影响SATB2基因的翻译表达，调节骨肉瘤细胞周期并促进骨肉瘤的增殖和生长。可见，lncRNA在骨肉瘤发生、发展中具有重要作用，可能是诊断骨肉瘤的新型候选生物标志物或潜在的治疗靶标。

3 lncRNA在骨肉瘤细胞增殖、凋亡中的作用

癌症发生的特征为不受控制的细胞周期活动，包括不受控制的DNA复制和亲代细胞分裂；细胞增殖与细胞凋亡之间的失衡促进了各种癌症的发展，归因于致癌基因激活和(或)抑癌基因失活。而lncRNA在骨肉瘤发生、发展过程中扮演致癌因子或抑癌因子角色，通过多种信号通路调节细胞周期进程或细胞凋亡，进而调节细胞增殖，控制骨肉瘤的进展。

3.1Wnt信号通路 Wnt信号通路在胚胎发育和成人组织动态平衡中起着至关重要的作用。肿瘤的发生和转移与Wnt信号通路的异常激活高度相关，特别是lncRNA的失调会激活Wnt信号转导通路，导致癌症生长和转移。研究显示，位于染色体21q22.3上的lncRNA整合素β2-AS1在骨肉瘤组织中显著上调，其通过调节Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号通路促进骨肉瘤的增殖并抑制骨肉瘤细胞凋亡，高表达的整合素β2-AS1预示骨肉瘤患者的总体生存率较低[18]。Li等[19]研究发现，lncRNA肌动蛋白纤维相关蛋白1(actin filament-associated protein 1，AFAP1)-AS1在骨肉瘤组织和细胞系中的表达显著上调，AFAP1-AS1高表达与骨肉瘤患者的预后不良有关；AFAP1-AS1可以通过海绵作用捕获miR-4695-5p，从而上调转录因子4的表达，转录因子4作为Wnt/β-catenin通路中的关键转录因子可促进骨肉瘤的增殖，AFAP1-AS1/miR-4695-5p/转录因子4/β-catenin信号转导级联通路被证实参与了骨肉瘤的发展进程。Huang等[20]发现，lncRNA BE503655在人骨肉瘤和骨肉瘤细胞系中过表达，过表达的lncRNA BE503655与Enneking分期、远处转移以及组织学分级密切相关，敲低lncRNA BE503655可抑制细胞增殖；进一步研究表明，lncRNA BE503655正常发挥功能取决于骨肉瘤中Wnt/β-catenin信号的调节。

3.2磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinases/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路 Akt作为一种原癌基因，在调控各种细胞功能的过程中发挥重要作用。PI3K/Akt信号通路通过促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，调控肿瘤的发生、发展。He等[21]研究表明，LINC00628在骨肉瘤组织中的表达显著减少，LINC00628低表达预示着总生存率较低，而过表达LINC00628的骨肉瘤细胞系增殖能力被显著抑制，细胞周期被阻滞在G0/G1期，凋亡率增加；此外，磷酸化的PI3K、Akt及Bcl-2蛋白表达水平显著升高，而p53蛋白表达水平显著降低，因此过表达的LINC00628通过PI3K/Akt信号通路的失活抑制骨肉瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡。肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是最早发现的与癌症相关的lncRNA之一，它参与了多种类型肿瘤的发生、发展，在肝细胞癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌和结直肠癌中均观察到MALAT1的异常表达[22-23]。慢病毒介导的MALAT1小干扰RNA可以有效下调骨肉瘤细胞株中MALAT1的表达水平，敲除MALAT1可抑制人骨肉瘤细胞的增殖；同时，增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶9以及磷酸化的PI3K p85α和Akt在缺失MALAT1的骨肉瘤细胞系中均受到抑制，表明MALAT1可能是通过PI3K/Akt信号通路促进骨肉瘤增殖、转移的致癌lncRNA，同时也被认为是骨肉瘤的潜在治疗靶标[24]。另有研究发现，赖氨酰氧化酶样蛋白1(lysyl oxidase like protein 1，LOXL1)-AS1的高表达与骨肉瘤患者的Enneking分期、肿瘤大小、远处转移、组织学分级以及总生存时间相关，骨肉瘤组织和细胞系中LOXL1-AS1的表达水平均高于正常骨组织和正常成骨细胞系，敲低LOXL1-AS1可通过抑制PI3K/Akt信号通路显著抑制骨肉瘤细胞的增殖[25]。

3.3转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号通路 TGF-β的过表达是许多癌症的标志，包括原发性骨肿瘤。肿瘤细胞或基质细胞分泌的TGF-β能够以旁分泌的方式有效调节微环境的表型和功能，从而刺激致瘤性微环境的变化，因此TGF-β可通过促进血管生成、骨重塑和细胞迁移，同时抑制免疫监视，在原发性骨肿瘤中发挥促癌作用[26]。与健康人相比，骨肉瘤患者血清中的TGF-β水平升高[27]。lncRNA核富集转录本1通过竞争性地刺激miR-339-5p介导TGF-β1的表达，增加的TGF-β1可诱导骨肉瘤细胞增殖，从而导致骨肉瘤的发展[28]。另有研究表明，lncRNA前列腺癌相关转录本(prostate cancer associated transcript，PCAT)6作为竞争性内源RNA通过海绵吸附miR-185-5p，上调TGF-β受体1和TGF-β受体2的表达，激活TGF-β通路，促进骨肉瘤的增殖进展[29]。

3.4信号转导及转录激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)信号通路 STAT3是在肿瘤细胞生长、增殖、凋亡和癌变中起重要作用的转录因子之一。在正常细胞中，STAT3被短暂激活以维持体内平衡，但如果STAT3在异常情况下持续被激活，则持续激活的STAT3可以触发致癌途径[30]。近年研究表明，应用STAT3抑制剂那巴布卡星诱导骨肉瘤细胞系可降低细胞活力并诱导细胞凋亡，应用那巴布卡星治疗除了可阻断STAT3介导的转录和骨肉瘤细胞下游靶蛋白外，还可抑制STAT3的表达和磷酸化[31]。Wang等[32]研究表明，lncRNA AK093407可与STAT3相互作用，并促进其磷酸化。在骨肉瘤中过表达的lncRNA持续活化STAT3通路，进而促进细胞增殖，同时抑制细胞凋亡。另有研究表明，lncRNA 膀胱癌相关转录本1(bladder cancer associated transcript 1，BLACAT1)在骨肉瘤组织和细胞中均上调，BLACAT1的上调预示骨肉瘤患者的预后不良；同时，上调表达的BLACAT1可以激活STAT3磷酸化途径，加速细胞增殖生长[33]。以上研究表明，lncRNA的异常表达参与了STAT3信号通路的活化，进而加速骨肉瘤的疾病进展。

3.5其他信号通路 Gao等[34]发现，lncRNA X染色体失活特异转录本作为一种肿瘤机会因子，抑制X染色体失活特异转录本会靶向激活核因子κB/PUMA(p53 upregulated modulator of apoptosis)通路，诱导细胞凋亡并减少骨肉瘤异种移植肿瘤的生长。另有研究表明，Notch途径被证实为一种骨肉瘤致癌途径，lncRNA母系印迹基因3的过表达可通过抑制 Notch信号通路抑制骨肉瘤细胞的增殖，并促进骨肉瘤细胞凋亡[35]。随着对lncRNA在多种致癌信号通路中作用机制的深入研究，lncRNA与骨肉瘤细胞更深层的增殖凋亡调控机制逐渐明晰，这些lncRNA 有望成为骨肉瘤治疗的潜在靶标。

4 lncRNA对骨肉瘤侵袭转移的影响

大多数骨肉瘤易发生早期远处转移，这也是骨肉瘤预后较差的重要原因[4]。肿瘤的侵袭与转移是一个多环节、多步骤、多基因参与的复杂调控过程，包括侵袭、内渗、扩散、外渗和定植。上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一种保守的细胞过程，以上皮细胞中的细胞极性丧失和间质细胞的发育为特征，可以侵入并在体内迁移，EMT被认为是肿瘤转移的重要机制；骨肉瘤细胞在转移前获得迁移增强的表型，完成EMT过程，从原发部位逃逸并侵袭邻近的组织，然后通过脉管系统转移至其他系统，形成远处的继发肿瘤灶[36]。

lncRNA也可通过调控EMT参与骨肉瘤侵袭和转移的过程。EMT过程中伴随上皮标志物(上皮钙黏素)下调和间质标志物(神经钙黏素)上调。研究表明，与癌旁的正常组织相比，lncRNA Ftx(Ftx基因是人类X染色体上的非蛋白质编码基因，也是一段位于X染色体失活中心的保守转录本)在骨肉瘤组织中的表达水平更高，其表达上调与临床分期及远处转移相关；lncRNA Ftx通过EMT机制影响骨肉瘤的进程，在蛋白质和信使RNA水平上皮钙黏素水平降低，而神经钙黏素水平升高，表明lncRNA Ftx可以作为判断骨肉瘤进展和预后的生物标志物[37]。lncRNA PCAT1在前列腺癌中首先被发现，随后PCAT1在其他恶性肿瘤中的作用也得到证实，包括结直肠癌、食管鳞状癌、膀胱癌、肝癌和肺癌等，而且在这些恶性肿瘤组织中PCAT1均被上调，PCAT1的过表达促进了癌症的进展；与正常骨组织相比，PCAT1在骨肉瘤组织中上调，PCAT1的上调与晚期临床阶段及肿瘤转移显著相关；体外研究表明，MG-63细胞中PCAT1的过表达增强了细胞的增殖、侵袭和迁移能力，并促进了EMT进程[38]。另有研究表明，在骨肉瘤中过表达的lncRNA HOXA远端转录本可能通过与c-Myc形成正反馈环促进体外迁移、侵袭和EMT过程[39]。

5 lncRNA与骨肉瘤预后的关系

骨肉瘤发现时往往伴随转移，预后一般较差。既往肿瘤的大小和部位、化疗反应、碱性磷酸酶水平和P-糖蛋白表达可能是判断骨肉瘤预后的独立因素，但随着对骨肉瘤相关lncRNA研究的深入发现，骨肉瘤组织中异常表达的lncRNA与患者的不良预后密切相关[40]。HOX转录反义RNA是研究较深入的lncRNA之一，它位于HOXC基因簇反义链内的人类染色体12q13上，与正常组织相比，骨肉瘤组织中的HOX转录反义RNA表达显著上调(P<0.001)；HOX转录反义RNA的过表达与晚期肿瘤阶段(ⅡA期比ⅡB/Ⅲ期，P=0.043 9)和高度组织学分级(Ⅲ级比Ⅳ级，P=0.009 7)以及较低的总生存率密切相关，提示高表达的HOX转录反义RNA与骨肉瘤患者的不良预后相关[41]。Chen等[25]发现，骨肉瘤组织和细胞系中LOXL1-AS1的表达水平均高于正常骨组织和正常成骨细胞系，且LOXL1-AS1的高表达与骨肉瘤患者的Enneking分期、肿瘤大小、远处转移、组织学分级以及总生存时间相关；此外，LOXL1-AS1的过表达是骨肉瘤患者总体生存的独立不良预测指标。总之，LOXL1-AS1可预测骨肉瘤患者的临床进展和不良预后，并作为致癌lncRNA调节细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭。另外，一些正在探索的lncRNA也被鉴定为骨肉瘤中独立的预后生物标志物。如一项针对94例骨肉瘤患者的肿瘤组织和相应的非癌性骨组织的鉴定研究表明，骨肉瘤组织中lncRNA牛磺酸上调基因1(taurine up-regulated gene 1，TUG1)的表达水平显著高于邻近的正常骨组织，TUG1的上调与骨肉瘤患者的肿瘤大小及晚期肿瘤阶段淋巴结转移均显著相关；Kaplan-Meier曲线显示，TUG1高表达的骨肉瘤患者总生存时间缩短；单因素和多因素分析表明，TUG1的低表达水平是骨肉瘤患者独立的不良预后指标[42]。这些发现表明，lncRNA有望成为骨肉瘤预后的生物标志物。将lncRNA作为预后生物标志物有利于骨肉瘤的早发现、早诊断、早治疗，有助于提高骨肉瘤患者的整体生存率，具有重要的潜在临床应用价值。

6 lncRNA与骨肉瘤的治疗耐药

在过去的几十年中，虽然包括新辅助化疗和外科手术切除在内的综合疗法已将骨肉瘤患者的5年生存率提高到了约70%[6]，但内在或获得性化疗耐药的发生显著阻碍了生存率的进一步提高，是癌症治疗的最大障碍[43]。骨肉瘤化疗耐药是一个多层次、多机制联合发挥作用的复杂过程，包括药物靶向基因表达下调、耐药基因表达异常等。Kun-Peng等[44]通过lncRNA微阵列分析分别测定了阿霉素耐药的人骨肉瘤细胞系和阿霉素敏感的人骨肉瘤细胞系(MG63/DXR与MG63)，结果发现，lncRNA FOXF1相邻的非编码发育调控RNA(FOXF1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA，FENDRR)在阿霉素耐药的骨肉瘤细胞中下调程度最高，且与骨肉瘤患者的不良预后呈负相关，FENDRR可能通过抑制ATP结合盒B亚家族1和ATP结合盒C亚家族1的表达发挥降低耐药性的作用；此外，FENDRR还可以作为预测骨肉瘤患者化疗敏感性和预后的生物标志物。这些结果阐明了FENDRR在降低骨肉瘤化学耐药性方面的新作用，并提出了潜在的靶点，以提高骨肉瘤对阿霉素治疗的敏感性。在骨肉瘤的顺铂化疗耐药研究方面，有研究表明，lncRNA NCK衔接因子蛋白1-AS1充当骨肉瘤的致癌基因，沉默NCK衔接因子蛋白1-AS1可改善对顺铂耐药的骨肉瘤细胞的敏感性；进一步的机制研究表明，NCK衔接因子蛋白1-AS1通过与miR-137竞争，调节骨肉瘤细胞中的顺铂耐药性[45]。此外，Wang等[46]报道，一种新型的lncRNA癌睾丸抗原可以被阿霉素激活，并通过竞争性结合miR-210促进骨肉瘤细胞凋亡，同时抑制细胞自噬。另有文献报道，lncRNA NR_036444是骨肉瘤多柔比星耐药形成过程中的重要分子，其可能作为区分骨肉瘤患者化疗敏感性和判断预后的生物标志物[47]。如果能够能筛选出对骨肉瘤化疗增敏的lncRNA并应用于临床化疗耐药的患者，将会显著提高化疗效果，改善骨肉瘤患者的预后。

7 小 结

近年来，与骨肉瘤发病密切相关的lncRNA的研究逐渐增多，为骨肉瘤的临床诊断以及lncRNA作为判断预后的生物标志物提供了新的契机，也为靶向精准治疗提供了理论基础。然而，lncRNA与骨肉瘤的作用关系仍存在亟待探索和解决的问题，如现有的研究尚不能阐明lncRNA异常表达与肿瘤形成的因果关系，其深层作用机制仍待进一步探索；另外，目前的研究仅局限于单个lncRNA 对骨肉瘤恶性生物学行为等方面的影响，多个lncRNA与骨肉瘤形成的交互调控网络值得深入研究；基因表达存在时空差异性，在不同部位的骨肉瘤以及同一部位不同肿瘤发展节点，lncRNA的表达丰度是否具有差异性，也值得深入研究。