姬名硕，王晓东，帕丽达·阿布利孜

(新疆医科大学第一附属医院皮肤科，乌鲁木齐 830054)

近年来，随着肿瘤大剂量化疗以及造血干细胞和实体器官移植的发展，侵袭性真菌感染(invasive fungal infections，IFI)患者逐年增多，目前已成为许多疾病致病和致死的重要病因[1-2]。虽然IFI的诊疗技术取得了一定进展，但IFI的真菌谱也随之发生了变化[3]。以往常见的白色念珠菌感染呈降低趋势，而以往并不常见的曲霉菌感染比例上升至第二位[4]。另外，还出现了许多新的真菌致病菌种，这些菌种的毒力和致病机制目前尚不明确。生物模型作为生命科学的研究工具，对于许多学科的发展和进步至关重要。蜡螟动物感染模型最初用于细菌病原体的毒力和发病机制的研究[5-7]，近年开始应用于真菌感染模型。蜡螟作为新的真菌动物感染模型，虽然缺乏统一的健康评定标准、繁殖条件不统一等会造成实验的偏差，但蜡螟动物感染模型相较于传统的哺乳动物感染模型生命周期短、价格低廉、操作简单且无伦理学限制，同时还可以了解真菌感染的全过程和免疫应答反应，为真菌毒力差异的初步研究、感染后的动态病理变化及体外药物敏感实验的研究提供了一个可靠的动物感染模型。现就蜡螟在真菌感染模型中的应用价值予以综述。

1 蜡螟模型的建立

蜡螟分布广泛，隶属于鳞翅目草螟科蜡螟亚科蜡螟属[8]。蜡螟的幼虫越来越多地用于细菌和真菌感染模型，研究真菌及细菌感染宿主后的毒力因子和发病机制。与传统的哺乳动物模型宿主相比，无脊椎动物感染模型的建立和维护成本更低，更适合大样本的研究；且蜡螟是蜜蜂的重要害虫，主要以幼虫蛀食巢脾，破坏贮藏的巢脾，进而侵害蜂群，直接影响蜂蜜的产量和质量[8]，因此，蜡螟用于感染模型并不受伦理学限制。此外，蜡螟还适用于真菌感染模型的研究，其具有如下特征：①蜡螟体积相对较大(15～30 mm)[8]，易于操作、精确剂量的注射以及收集组织、淋巴血，用于下游的实验分析；②蜡螟的免疫系统与脊椎动物的先天免疫系统在结构和功能上具有高度同源性，因此具有细胞和体液免疫功能[9-10]，其体液免疫反应包括黑化、血淋巴凝结以及产生抗微生物肽，而细胞反应则包括吞噬作用和产生大量包囊[11-12]；③蜡螟可以在37 ℃恒温条件下生长繁殖，这是真菌感染体内研究的重要因素[5]。基于以上特点，蜡螟真菌感染模型已初步建立并被科学界广泛接受，且已在烟曲霉、白念珠菌、隐性球菌等真菌感染模型的研究中取得了初步成果。

2 蜡螟模型与真菌感染

2.1烟曲霉 烟曲霉是一种机会性真菌病原体，是侵袭性曲霉病的主要致病物种，而IFI是一种与高病死率相关的全身性疾病[4]。IFI的治疗依赖于数量非常有限的抗真菌药物。为了扩大抗真菌药物的范围，确定某种药物的疗效，必须有体外动物感染药物治疗的评估。有研究发现，青蒿琥酯可通过抑制烟曲霉的活性、升高蜡螟淋巴细胞的自噬水平，以增强蜡螟对抗烟曲霉的感染，这项研究不仅证明了蜡螟可用于真菌药物的体外实验，也为临床药物评估提供了可靠依据[13-14]。另有学者发现，内质网-线粒体结构偶联(endoplasmic reticulum-mitochondria encounter structure，ERMES)是一个潜在的药物靶点，他们借助蜡螟感染模型发现，ERMES有助于增强烟曲霉的毒力，且抑制ERMES可以减弱烟曲霉病原体的活性[15]。因此，蜡螟感染模型可用于体外真菌感染发病机制的研究，为临床治疗提供理论支持。这些研究结果表明，蜡螟幼虫可能是研究侵袭性曲霉菌病发展阶段的一个方便模型。然而，由于哺乳动物中的呼吸系统在蜡螟中并不存在，使用蜡螟模型模拟真菌感染肺部后的免疫反应无法实现[15-16]。可见，由于蜡螟与哺乳动物存在结构上的差异，蜡螟在一定程度上可以取代哺乳动物作为体外动物实验研究模型，但蜡螟作为体外动物感染模型还存在一定的局限性。

2.2念珠菌属 念珠菌属是免疫功能低下时IFI的主要病原体，是血液感染的第四大常见原因，其感染的病死率可达35%以上[17-18]，且不断有新的变异菌株出现。为了检测新菌株的毒力和药物敏感性，需要建立适当的模型进行评估，这对于临床药物治疗至关重要。有研究通过构建白色念珠菌大蜡螟动物感染模型成功证实了白念珠菌不同菌株的毒力和对感染的免疫反应，该研究证实了大蜡螟可以被白念珠菌感染，且可用于测试不同菌株间毒力的差异[19-20]。此外，白色念珠菌感染大蜡螟药物的体外实验也取得了一定进展。有研究通过白色念珠菌蜡螟模型证实，光动力疗法治疗可以延长被白色念珠菌感染的幼虫寿命[21]。有学者利用真菌感染蜡螟的淋巴细胞后，在细胞培养箱中加入活性氧类探针和溶酶体探针，观察真菌刺激细胞时自噬水平的变化，结果发现，活性氧类水平升高、溶酶体和菌共定位，说明蜡螟细胞的自噬性在抗真菌感染中发挥保护作用[19]。可见，在念珠菌属中，无脊椎动物模型同样也可用于初步探讨不同菌种的毒力、抗真菌药物的疗效以及宿主感染真菌后的作用机制。

2.3新生隐球菌 新型隐球菌是一种机会性真菌病原体，在免疫抑制患者中，尤其在人类免疫缺陷病毒感染者和移植受者中可传播或侵入中枢神经系统，导致致命的脑膜炎[22]，并造成每年约60万人死亡[23]。荚膜是新生隐球菌的重要毒力因子，可维护菌体内环境的稳定及抵御宿主细胞免疫的吞噬作用，其他的毒力因子还包括黑色素、分泌性酶等，这些毒力因子可诱导产生免疫反应[24-25]。此外，新生隐球菌为细胞内的真菌病原体，可在吞噬病原体的细胞内存活和复制。新生隐球菌感染哺乳动物后可产生抗微生物肽并诱导吞噬细胞发挥抗菌作用，这些免疫反应同样也存在于无脊椎动物中，蜡螟作为无脊椎动物，在感染新生隐球菌后可在血淋巴细胞中裂解并繁殖，这种在哺乳动物和无脊椎动物中类似的免疫反应是蜡螟感染模型用于研究微生物发病机制的基础[26]。近年来，有研究通过开发蜡螟动物感染模型研究隐球菌的毒力、宿主感染后的免疫反应以及抗真菌化合物的作用发现，所有隐球菌的菌种在注入蜡螟体内后均会被血细胞吞噬，但仍会在宿主体内增殖，并将蜡螟杀死，杀灭的速度和程度取决于新生隐球菌菌株以及注射的真菌孢子的数量；同时该研究还发现，无论在新生隐球菌感染前还是感染后，给予复合抗真菌疗法(两性霉素B+氟胞嘧啶)均较单一疗法更能延长蜡螟的存活时间并减少血细胞中隐球菌的数量[27-28]。

有研究将蜡螟作为新生隐球菌的感染模型，通过观察蜡螟的致死率并研究其毒力，最终得到的结果与使用鼠类模型研究隐球菌毒力的结果一致[27]，表明蜡螟模型作为真菌感染模型研究菌毒力是准确且具有潜力的。由此证明，蜡螟动物感染模型在研究新生隐球菌毒力方面可一定程度上替代哺乳动物模型，且有助于研究体内抗真菌治疗的效果，为临床抗真菌药物试验提供基础研究。

2.4马尔尼菲篮状菌 马尔尼菲篮状菌是一种热双态真菌病原体，在获得性免疫缺陷综合征患者中更易导致严重感染[29-30]。有研究在24 ℃环境下用马尔尼菲篮状菌感染蜡螟模型，结果发现，在接种24 h后，马尔尼菲篮状菌转变为裂殖酵母形态[31]。在哺乳动物细胞中，吞噬作用需要在识别病原体后进行，且主要通过来源于骨髓细胞系的吞噬细胞进行。吞噬作用需要连续的信号转导，导致吞噬细胞募集到感染部位，然后将真菌颗粒识别为外来物并吞噬、摄取，虽然目前对昆虫吞噬作用的过程尚不完全清楚，但血淋巴细胞和粒细胞表面的受体与哺乳动物吞噬细胞上的受体相似[32]。研究显示，蜡螟在感染2 h后血淋巴细胞密度开始增加，通过冷冻成像和荧光显微镜检查发现，6 h时幼虫体内的真菌在组织中形成明显的结节，24 h时在感染部位及较远的其他部位均可见一系列结节，表明真菌已侵入蜡螟组织内[33]。由于脊椎动物与昆虫感染的先天免疫反应具有相似性，昆虫在体内评估微生物致病性方面具有潜在用途。

另有研究证实，马尔尼菲菌接种剂量的增加可导致幼虫死亡率增加，同时幼虫死亡率也取决于感染蜡螟动物模型后的培养温度；此外，血淋巴细胞是蜡螟幼虫免疫防御的关键组成部分，蜡螟体内血淋巴细胞对马尔尼菲氏菌有吞噬作用，且在真菌感染期吞噬作用增强[30]。上述研究均表明，蜡螟感染模型可有效应用于机体感染马尔尼菲篮状菌后相互作用机制的研究。可见，蜡螟动物感染模型在研究马尔尼菲篮状菌的毒力、免疫反应以及菌体与宿主的相互反应中具有潜在价值。

2.5镰刀菌 镰刀菌是在环境中常见的丝状真菌，可在动物和植物中引起真菌病。人类感染包括真菌病、角膜炎和甲真菌病，免疫功能降低的患者会发生深部真菌感染[34-35]。为了更好地了解真菌与宿主之间的相互作用，有研究开发了大蜡蛾幼虫作为新的感染宿主模型，将镰刀菌分生孢子注入大蜡蛾幼虫的血细胞后，可在37 ℃时杀死幼虫，且在30 ℃温育时幼虫死亡的速度更快，但大蜡蛾幼虫死亡的影响因素除温度外，还包括镰刀菌菌株分生孢子的数目及形态等，该研究通过蜡螟动物感染模型进一步证实了大分生孢子较小分生孢子更具毒性，同时从侧面证实了蜡螟模型在镰刀菌毒力研究中具有一定的研究价值[36]。

镰刀菌对大多数抗真菌药耐受，抗真菌药物耐药性频繁发生，推动了利用动物感染模型来确定新的耐药靶点以及对药物疗效评价的研究。有研究用蜡螟作为感染模型发现，两性霉素B能显著增加镰刀菌感染的幼虫存活率[37]。镰刀菌感染蜡螟模型不仅揭示了镰刀菌毒力的影响因素，也为哺乳动物模型提供了一种合适的替代方案[38]，以研究宿主与该真菌病原体之间的相互作用，同时在抗真菌药物疗效的研究中也具有一定价值。

2.6暗色真菌 暗色真菌是引起暗色丝孢霉病的主要原因，从创伤引起的局部感染到免疫功能降低患者均可感染暗色丝孢霉病，严重时可危及中枢神经系统并导致死亡。暗色丝孢霉病单独切除可以治愈局部感染，而全身性疾病通常难以治疗[39]，且任何菌种及浓度均可激活体液免疫应答反应，其中卡氏枝孢霉在暗色真菌中最具毒性[40]。传统的哺乳动物模型由于基因组与人类高度同源且脏器与人类相似，可高度模拟人类感染真菌后的临床特点及病理机制[32]，但在传统动物模型中真菌感染的毒力过程不容易观察，而蜡螟表面在病原体感染后可发生黑色素化，故解决了这一难题。有研究利用蜡螟感染模型替代哺乳动物模型分析了不同暗色真菌菌株的毒力和宿主对暗色真菌不同菌株的免疫应答，结果通过血淋巴细胞浓度的改变和体表黑色素反应的变化发现了不同菌株毒力的差异[33,38,41]。蜡螟动物感染模型作为一种新的无脊椎动物宿主模型，可用于评估暗色真菌的毒力，为进一步克服目前体外研究暗色真菌病的局限性提供了可能。

3 小 结

蜡螟动物感染模型已受到广泛关注。蜡螟动物感染模型具有简单、易操作的优点[12,42]，在不同菌种间毒力的比较、感染真菌后的免疫机制以及抗真菌药物的初步疗效中已取得了相关进展[19,27,39,41]。与秀丽隐杆线虫、果蝇等成熟无脊椎动物模型相比，蜡螟模型目前还处于起步阶段，未建立动物饲养标准和评价标准，蜡螟基因库也未完全建立[43]。蜡螟的局限性在一定程度上降低了实验的可重复性，未来应尽早建立蜡螟基因库，解决蜡螟健康评分标准及实验室培养条件标准化等问题，以有助于蜡螟模型发展为更加可靠的动物感染模型。