李勇爱，原文琦，王辉，师志云，牛宁奎

(1.宁夏医科大学，银川 750004； 2.上海交通大学医学院，上海 200025；3.宁夏医科大学总医院 a.脊柱骨科，b.医学实验中心，银川 750004)

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染导致的一类严重危害人类健康的慢性传染性疾病。结核菌主要侵犯肺脏，骨与关节结核是常见的肺外结核。MTB是典型的胞内致病菌，宿主细胞是巨噬细胞，抗结核反应主要以T细胞介导的细胞免疫反应为主。MTB侵入机体后，被巨噬细胞吞噬形成吞噬小体，与溶酶体结合后被降解为肽段，通过主要组织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ类分子将抗原多肽呈递给CD4+T和CD8+T细胞，启动适应性免疫应答，MTB的主要致病力来自脂质阿拉伯甘露聚糖(mannose-capped lipoarabinomannan，ManLAM)，而CD1作为受体直接与ManLAM结合并介导MTB侵入宿主细胞[1-2]。作为信号通路的上游分子，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)并不像CD1和Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)那样直接与MTB菌壁成分或炎症因子结合而发挥作用[3-4]。TGF-β具有广泛的生物学作用，可影响细胞增殖、分化、迁移、凋亡和组织损伤、修复、炎症反应以及骨组织重建[5]。TGF-β信号通路不仅通过Smads经典途径发挥作用，也可通过激活或抑制非经典途径影响其他通路，从而广泛参与结核病的发生、发展[6]。现就TGF-β信号转导通路在结核病中的研究进展予以综述。

1 TGF-β信号转导通路概述

1.1TGF-β的分型、形成及活性方式 在哺乳动物中，TGF-β分为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种亚型，TGF-β1和TGF-β2在骨中含量最高，TGF-β3主要来源于由间充质干细胞分化而来的细胞[7]。TGF-β1互补DNA编码产生由390个氨基酸组成的前体蛋白(包含29个氨基酸的信号肽和361个氨基酸的前体蛋白)，前体蛋白经转化酶处理后生成潜伏相关肽和成熟的TGF-β1[8]。潜伏相关肽与TGF-β1以二硫键形成的二聚体在分泌后保持非共价结合的形式，形成潜伏性TGF-β1复合物；潜伏相关肽与3种潜伏性TGF-β结合蛋白中的一种共价连接，产生一种能与细胞外基质相互作用的复合物[9]。潜伏期的TGF-β在纤溶酶、基质金属蛋白酶、血小板反应蛋白1等的作用下被激活[10-12]。

1.2TGF-β/Smads经典信号转导通路 Smads蛋白是TGF-β经典通路中不可或缺的下游分子，根据功能不同Smads蛋白可分为3类：①受体调节性Smads，包括Smad1、Smad 2、Smad 3、Smad5和Smad8，其中Smad1、Smad 5和Smad8调节骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信号通路，Smad2和Smad3调节TGF-β通路；②共同介导性Smads，包括Smad4和Smad10；③抑制性Smads，包括Smad6和Smad7，Smad7可抑制Smad3[13-14]。Smads蛋白是TGF-β家族从细胞膜受体到细胞核的胞内信号转导分子，TGF-β的多种调节作用通过这一途径实现[15]。TGF-βⅡ型受体(transforming growth factor-βⅡ receptor，TGF-βRⅡ)可识别结合TGF-β但不能激活Smad2/3，TGF-βⅠ型受体(transforming growth factor-β Ⅰ receptor，TGF-βRⅠ)能激活Smad2/3但不能结合TGF-β，因此，TGF-β先与膜上的TGF-βRⅡ结合，进而导致TGF-βRⅠ在高度保守的膜旁区募集[8]。活化的TGF-βRⅠ磷酸化其下游的Smad2和Smad3，磷酸化的Smad2/3与Smad4形成异寡聚物复合物并转移到细胞核，在启动子处与DNA序列特异性结合位点及Smads结合元件处的其他转录因子相互作用发挥生物学效应[16]。TGF-β非Smads依赖的非经典途径包括促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信号通路、蛋白激酶B信号通路、胞外信号调节激酶信号通路、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信号通路和Toll样受体信号通路等[17-19]。

2 TGF-β信号转导通路参与结核病的发病机制

2.1TGF-β信号转导通路调控被MTB感染的宿主细胞的凋亡过程 单核/巨噬细胞是MTB主要的宿主细胞，肺巨噬细胞与破骨细胞由单核/巨噬细胞分化而来，也是MTB的宿主细胞，因此MTB也可侵入Ⅱ型肺泡上皮细胞[20-22]。TGF-β/Smads经典途径、非Smads依赖途径相互作用影响宿主细胞的凋亡，与之相关的分子包括Smad3、TGF-β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)、黏着斑激酶以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)等。

TGF-β/Smads经典途径对被MTB感染的宿主细胞有促凋亡作用。Smad2或Smad3与Smad4形成复合物并转移至细胞核内，在启动子处与DNA序列特异性结合位点及Smads结合元件处的其他转录因子相互作用，下调MAMBI基因的表达，并上调细胞因子信号转导抑制因子3基因的表达，诱导巨噬细胞凋亡[23-24]。TAK1是MAPK家族的一员，TGF-β作为生长因子可激活TAK1，即TGF-β与TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ结合形成复合物时可激活TAK1并使之磷酸化，而磷酸化的TAK1可与JNK、p38相互作用并磷酸化JNK、p38，从而介导JNK、p38 MAPK信号通路引起的促凋亡作用[17,25-27]。此外，MPT53作为一种MTB的分泌蛋白，可直接与TAK1相互作用，并以Toll样受体2或髓样分化因子非依赖性的方式激活TAK1[28]。TGF-β通路可下调肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达，TNF-α与其受体结合通过TNF-α/胱天蛋白酶、TAK1两条途径诱导凋亡[29]。TGF-β/TGF-β受体复合物激活的TAK1还是核因子κB信号通路的上游分子，可介导该通路的泛素化作用[30]。TAK1亦可促进TGF-β/Smads经典通路的信号转导，加强TGF-β/Smads通路自身的促凋亡效应[31]。

Smad3属于受体调节性Smads蛋白，对于巨噬细胞、破骨细胞和肺泡上皮细胞，Smad3在TGF-β/Smads经典信号通路中处于重要位置。TGF-β1/Smad3经典通路的激活可上调血管生成素1/2的表达，增加蛋白激酶B磷酸化，进而诱导巨噬细胞凋亡[16]。B淋巴细胞瘤2通过控制细胞内外物质的运输、抑制钙离子的释放以及阻止细胞内过氧化物的积累发挥抗凋亡作用，而这种抗凋亡作用可能被磷酸化的蛋白激酶B影响[32]。血管生成素1/2可增强TGF-β/Smads经典通路，而血管生成素1/2与TGF-β/Smads的协同作用可放大TGF-β通路在巨噬细胞中的促凋亡效应[16,33]。在肺泡上皮细胞中，黏着斑激酶在调节TGF-β通路促凋亡效应中起重要作用，只有黏着斑激酶受到显著抑制时才会产生显著的促凋亡效应[34]。

在骨结核中，TGF-β通路还可通过上调白血病抑制因子而抑制破骨细胞凋亡[35]。在有关破骨细胞凋亡的信号通路网中，破骨细胞对TRAIL介导的TNF-α通路发挥重要作用，TRAIL与其受体结合，导致胱天蛋白酶8启动子通过泛素相关死亡域蛋白被死亡诱导信号复合体募集后激活[36-37]。TGF-β作为TRAIL受体1的抑制剂和TRAIL受体2的激活剂，通过调控TNF-α通路影响破骨细胞凋亡[36]。

TGF-β信号通路的促凋亡效应可拮抗MTB调控TNF-α和Toll样受体通路而产生的抗凋亡作用，但MTB对宿主细胞的整体效应表现为抗凋亡作用，使MTB能在宿主细胞内长期存活、繁殖，这可能与MTB直接或间接抑制TGF-β通路有关。TGF-β信号通路的效应依赖于对多个基因表达的控制，这些基因的表达依赖于Smads蛋白以及TGF-β/Smads信号通路各种调节因子的功能。Ski基因和核转录共抑制因子通过干扰受体调节性Smad/Smad4复合物的形成，负性调节TGF-β信号通路[15]。此外，下调的TAK1可抑制TGF-β通路的促凋亡作用，还能激活坏死性凋亡信号导致宿主细胞死亡，进而导致MTB释放[29]。因此，TGF-β信号通路的促宿主细胞凋亡效应不利于MTB存活，但这种效应会被TGF-β信号通路的负调控因子直接或间接抑制，其中TAK1为MTB调控宿主细胞从抗凋亡状态至坏死状态的关键因子，以达到早期抗凋亡利于MTB存活、繁殖，后期诱导宿主细胞死亡利于MTB释放的目的。MTB能在不同阶段(休眠期、活跃期等)对TGF-β信号通路进行不同的调控，并系统性地调控宿主细胞内TGF-β信号通路，以调整宿主细胞的存活状态，从而利于MTB自身的生存、繁殖及致病。

2.2TGF-β信号通路在结核病中发挥免疫抑制作用 MTB诱发的宿主免疫反应包括体液免疫和细胞免疫，涉及多种免疫细胞和细胞因子，TGF-β是调节淋巴细胞活化、生长和分化的细胞因子之一[38]。巨噬细胞和淋巴细胞在特异性抗原刺激下被激活，产生并释放TGF-β1，TGF-β1又以自分泌或旁分泌的方式作用于巨噬细胞和淋巴细胞[39]。宿主细胞分泌的TGF-β1蛋白可通过拮抗促炎症因子的作用抑制巨噬细胞的活化，促进MTB在巨噬细胞内生长与繁殖，抑制细胞毒性T淋巴细胞的成熟以及T细胞对多克隆有丝分裂原的增殖反应或混合淋巴细胞反应等，其中树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子、视黄酸相关孤儿核受体γt(retinoid-related orphan receptor γt，RORγt)、细胞间黏附分子-1、Ski基因、蛋白酶激活受体1、血管生成素样蛋白4等分子与TGF-β信号通路发挥免疫抑制作用密切相关。

TGF-β/Smads经典通路形成的异聚体Smads复合物在启动子处与DNA序列特异性结合位点及Smads结合元件处的其他转录因子相互作用，异聚体Smads复合物还与p300和cAMP应答元件结合蛋白等转录辅激活物或转录辅阻遏物相互作用，将TGF-β/Smads与基础转录机制相联系，介导TGF-β的生物学效应，下调TNF-α、γ-干扰素(interferon γ，IFN-γ)、白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-12以及IL-6等炎症因子的表达[1,40]。ManLAM作为结核菌重要的致病物质在免疫抑制反应中起重要作用，除与甘露糖受体结合外，在树突状细胞中ManLAM还能以其特有的树突状细胞特异性细胞间黏附分子-3-结合非整合素分子为靶点，介导TGF-β和IL-10抑制性炎症因子的产生[1,41-42]。

TGF-β在调节性T细胞(regulatory T cell，Treg细胞)、辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)和细胞毒性T淋巴细胞的分化中均具有重要作用[43-45]。TGF-β可诱导未成熟T细胞在激活过程中表达叉头框蛋白P3[46]。叉头框蛋白P3作为Treg细胞的标志物可直接与RORγt相互作用，并拮抗Th17细胞产生TGF-β、IL-17和IL-21等因子；TGF-β也可激活RORγt，通过蛋白酶降低叉头框蛋白P3，表明TGF-β通路对Treg细胞的数量有精确的双向调控作用[47]。TGF-β在效应T细胞与抗原呈递细胞相互作用的不同时期以不同的机制抑制抗原呈递过程和抗原呈递细胞、效应T细胞的活化过程，进而抑制抗结核免疫；早期Treg细胞并不影响Th细胞活化的过程，而是以TGF-β依赖的方式影响下游因子，从而抑制Th细胞的极化过程；后期TGF-β抑制Th细胞诱导抗原呈递细胞表面CD40和细胞间黏附分子-1的表达，阻断抗原呈递细胞与Th细胞的非特异性结合[45]。MTB也可通过抑制TGF-β的促凋亡效应延迟Treg细胞的应答并降低其释放炎症因子的能力，表明MTB可增强TGF-β本身的抑制抗结核免疫[48]。在Th17细胞中，IL-6或IL-21可激活信号转导及转录激活因子3以增强转录因子RORc的表达，而RORc可上调RORγt的表达，促使T细胞产生TGF-β、IL-17和IL-21等，而TGF-β又可降解Ski以逆转Ski/Smad4复合物对RORc转录的抑制作用[47,49]。因此，TGF-β既能以一种类似正反馈的方式促进自身、IL-17和IL-21的表达，增加Th17的作用，也能通过Treg细胞抑制Th17的作用。此外，不同浓度的TGF-β对Th17、Treg细胞的影响不同，高浓度的TGF-β促进Treg细胞的分化，低浓度的TGF-β促进Th17细胞的分化[40]。Th0细胞分化为Th1细胞需要IL-12和IFN-γ的参与，且IL-12和IFN-γ的协同效应是细胞毒性T淋巴细胞分化和增殖的必需条件，TGF-β/Smads经典通路通过下调IL-12和IFN-γ的表达，全面抑制细胞免疫对感染MTB的巨噬细胞的杀伤作用[1,50-51]；同时，下调IL-21可影响浆细胞的分化、抗体的形成及抗体类别转换等过程，抑制体液免疫对MTB的清除[52]。

在骨结核中，TGF-β1/Smad3通路下游的转录因子与蛋白酶激活受体1启动子结合、TGF-β2/Smad3通路下游的转录因子与血管生成素样蛋白4启动子结合，均能诱导破骨细胞的形成和分化[53-54]。在经典通路中，TGF-β1/Smad1通路抑制破骨细胞的分化，而TGF-β1/Smad3促进破骨细胞的增殖、分化[55]。在非经典通路中，TGF-β1通过抑制破骨细胞内核因子κB受体活化因子配体介导的核因子κB通路抑制p38 MAPK通路，也可通过促进成骨细胞、巨噬细胞释放核因子κB受体活化因子配体和巨噬细胞集落刺激因子等破骨细胞分化因子促进破骨细胞的增殖、分化[55-58]。由此可见，TGF-β1的经典和非经典通路均对破骨细胞有双向调节作用。

总之，TGF-β信号通路对细胞免疫和体液免疫均有抑制作用，通过下调TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-12以及IL-6等炎症因子的表达以及对巨噬细胞、树突状细胞、Treg细胞、Th细胞、细胞毒性T淋巴细胞等的分化和功能调节发挥免疫抑制作用。在骨结核中，TGF-β1/Smads经典通路以及核因子κB、p38 MAPK等非经典通路通过影响破骨细胞和成骨细胞的形成、增殖及分化，参与抗结核免疫调控。TGF-β在不同浓度、结核感染的不同阶段诱导不同的Smads蛋白，发挥促进或抑制免疫反应的作用，如TGF-β通路对Treg细胞数量的双向调控作用以及TGF-β1经典和非经典通路对破骨细胞分化和功能的双向调节作用。

2.3促进肉芽肿的形成、利于MTB免疫逃逸 结核性肉芽肿是MTB感染巨噬细胞的典型特征及消灭结核菌的免疫结构，是由外周血来源的被感染和未被感染的巨噬细胞、上皮样细胞和朗格汉斯细胞、成纤维细胞等聚集而成的致密的病理改变，过量的结核性肉芽肿会包裹MTB，使其逃避抗结核免疫，未被宿主清除的MTB存在于结核性肉芽肿中，处于休眠状态，当宿主免疫力降低时，结核病复发、再燃，而TGF-β是形成结核性肉芽肿的关键基因[43]。早期肉芽肿和晚期肉芽肿中的多核巨细胞、上皮样细胞均有不同程度的TGF-β1表达[59]。TGF-β1信号通路可诱导调节单核细胞趋化蛋白-1、IFN-γ诱导蛋白-10及CX3C趋化因子配体1的表达，这些趋化因子可在组织中形成浓度梯度，将单核细胞/巨噬细胞、T细胞、淋巴细胞和粒细胞等趋化、激活，并聚集、参与肉芽肿的形成[41,59-60]。TGF-β1介导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化、胶原生成，并积聚、产生细胞外基质，若细胞微环境中IL-10相对不足，介导肌成纤维细胞向成纤维细胞分化的反应弱，细胞外基质则会过度堆积[56,61]。以纤维化病变为主的肉芽肿主要出现在潜伏性结核病中，但也出现在一些活动性结核病中，镜下可见病变几乎全部由成纤维细胞组成，只有少量巨噬细胞，这种类型的病理改变更利于MTB免疫逃逸[42]。此外，TGF-β通路可下调TNF-α、IFN-γ水平，而典型肉芽肿结构的形成需要TNF-α、IFN-γ的参与；TNF-α、IFN-γ通路也可通过诱导趋化因子的表达使免疫细胞到达肺部且到达感染部位，若阻断TNF-α通路，细胞因子可进入肺部，但不会集中在感染部位，与其他免疫细胞相互作用形成致密的免疫结构[1,40]。TGF-β通路自身可促进成纤维细胞和肌成纤维细胞的增殖、分化，易形成以纤维为主的病理改变，以纤维化病变为主的肉芽肿主要出现在潜伏性结核病中，这可能与潜伏性结核病中TGF-β水平升高以及IFN-γ水平降低有关[43,48,56]。

TGF-β在骨细胞中可调节成骨细胞和破骨细胞的分化和功能，从募集到分化，促进骨形成、骨吸收和骨重建。破骨细胞分泌氢离子并创造酸性微环境，利于释放和激活骨基质中的TGF-β[62]。TGF-β1可由成骨细胞产生并以自分泌的形式对成骨细胞的复制和基质的合成起双向调节作用，在低骨吸收状态下，TGF-β1浓度相对较低，TGF-β1刺激可促进破骨细胞分化；在高骨吸收状态下，产生的较高水平的TGF-β1可抑制破骨细胞的分化和成熟破骨细胞的凋亡，并在抑制破骨细胞分化的情况下维持高骨吸收状态，这可能与TGF-β刺激核因子κB受体活化因子配体分泌、增加溶骨活性有关[35]。TGF-β1的溶骨效应不利于肉芽肿局限MTB，导致骨质破坏引起脊柱椎间隙狭窄、冷脓肿形成和后凸畸形[63-64]。

2.4TGF-β调控被MTB感染的宿主细胞的铁代谢 结核病患者的铁摄入量与死亡风险呈正相关[42]。宿主细胞内的MTB通过激活Rab5及转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR)介导吸收外源性铁元素，铁是MTB编码酶作用中不可或缺的辅助因子，不仅参与电子传递和氧化代谢，还是合成氨基酸、嘧啶核苷酸以及一系列营养和遗传物质的必需元素之一，铁的获取对MTB的生长、繁殖至关重要[65-66]。因此，宿主细胞可通过限制铁的摄入阻止MTB的生长和繁殖[67]。TGF-βRⅠ根据激酶不同分为5种亚型，其中激活素受体样激酶1/5复合物介导TGF-β1经触发Smad1/5/8磷酸化，诱导铁调素的产生，而激活素受体样激酶2/3介导BMP经Smad1/5/8诱导铁调素的产生，而铁调素的水平与铁离子水平呈显著负相关[65,68]。尽管这两条通路的配体和受体均不一致，但两者均需要经Smad1/5/8发挥效应，提示TGF-β1和BMP通过磷酸化Smad1/5/8诱导铁调素产生，进而降低铁的水平，发挥抗结核效应。但作为另外两种受体调节性Smads，Smad2/3的过表达可调控Smad1/5/8的磷酸化水平，其正向与负向调控方向均有报道，这可能与不同的结核类型及细胞环境有关[68]。肺结核患者的血清铁水平较健康人群低，这可能与TGF-β1和BMP调控铁的作用有关[69]。

被感染的巨噬细胞内的MTB与宿主争夺有限的可用铁资源，MTB从铁储存分子(如转铁蛋白、乳铁蛋白和铁蛋白)中提取铁元素。转铁蛋白结合的铁元素通过与巨噬细胞、自然杀伤细胞膜上的TfR结合，以网格蛋白依赖的方式经内吞作用进入细胞内，内体中的铁通过还原和酸化作用排出，并通过自然抗性相关巨噬细胞蛋白(natural resistance-associated macrophage protein，Nramp)1和Nramp2转运至细胞质，使吞噬体中的MTB无法获取铁元素，从而抑制MTB的生长、发育和繁殖[66]。TGF-β通路可通过TfR、Nramp1等蛋白影响铁元素的代谢。TGF-β通路的免疫抑制作用减弱了肺泡巨噬细胞的抗菌活性，MTB可在肺泡间转移，其抗原也可被呈递，使周围的T淋巴细胞致敏[43,70]。TGF-β通路可抑制淋巴细胞活化和淋巴因子的产生，如TNF-α、IL-6和INF-γ，这三者的协同作用可杀死病灶中的MTB[1,40,70]。IFN-γ可刺激Nramp1的表达，而Nramp1是一种用来抵御利什曼原虫、MTB及其他病原体入侵的膜蛋白，通过将铁离子从内体泵入胞质，限制MTB对铁的获取[71]。因此，TGF-β通路能以抑制IFN-γ/Nramp1的方式抑制MTB对铁离子的摄取。TGF-β还可抑制IL-2/IL-15诱导的TfR在细胞膜上的表达，进而阻碍MTB的生长、繁殖，其主要作用机制并不是通过典型的Smads信号通路，而是通过TGF-β直接抑制IL-2/IL-15诱导的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1来实现[72]。因此，TGF-β经典和非经典通路可经铁调素、Nramp1、Nramp2和TfR等蛋白调节宿主细胞内铁元素的代谢，抑制MTB获取其生长、发育、繁殖必需的铁元素，发挥抗结核效应。

3 小 结

TGF-β信号通路具有多种生物学效应。TGF-β对T细胞的分化以及下游转导途径的选择性激活与TGF-β的浓度和种类、细胞所处的微环境均密切相关。MTB能以时间性、系统性的方式调控宿主细胞内TGF-β信号通路，以促进自身的抗结核效应，该过程涉及许多重要的蛋白和基因。不同浓度的TGF-β、结核感染的不同阶段诱导不同的Smads蛋白，可发挥抗结核或促结核的双向作用。在骨结核中，TGF-β1的经典通路和非Smads非经典通路在不同微环境下均可对破骨细胞产生双向调节作用，后续在该领域的研究可能为新型抗结核药物的研发提供新的作用靶点。