曾继莎，屈 敏，刘红英

方便、快速早期诊断是提高食管鳞状细胞癌患者治疗效果、改善其预后的重要措施。肿瘤标志物是最为普遍的肿瘤辅助诊断手段[1]，但需要根据肿瘤类型选择合适标志物，而目前临床关于食管鳞状细胞癌尚缺乏特异性肿瘤标志物。近年有研究报道，除常见的癌胚抗原(carcinoembryonic antigen， CEA)和肿瘤生长因子(tumor growth factor， TGF)等肿瘤标志物可以用于肿瘤早期诊断外，还有肿瘤基因p53抗体和微小RNA-451(microRNA-451， miR-451)等[2-3]。miR-451在诊断食管癌方面有重要价值，以往研究多通过分析组织中miR-451水平对食管癌进行诊断，但事实上miR-451在血清中能以游离形式长期存在[4]。因此，本研究探讨血清p53抗体、miR-451及CEA在食管鳞状细胞癌诊断中的应用价值，以期为食管鳞状细胞癌的临床诊断提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1月—2020年1月攀钢集团总医院收治的符合纳入及排除标准的食管鳞状细胞癌89例作为观察组，其中男72例，女17例；年龄39～76(61.52±9.36)岁；病程1～12(3.52±1.06)个月；TNM分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期42例，Ⅲ期38例；分化程度：高分化24例，中分化45例，低分化20例；肿瘤直径：>3 cm 50例，≤3 cm 39例。另选取同期在该院进行体检的健康体检者89例作为对照组，其中男69例，女20例；年龄38～77(61.79±9.53)岁。两组性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准同意；所有研究对象和(或)其家属均知情同意，并签署相关知情同意书。

1.2纳入及排除标准 纳入标准：①符合《食管癌规范化诊治指南》第2版[5]中食管鳞状细胞癌诊断标准，且经术后病理学检查确诊；②具有食管癌手术指征，术前未进行放化疗。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②食管腺癌者；③合并其他严重胃和食管疾病者；④心、肝、肾和脑等重要器官严重疾病者；⑤不能正常沟通交流者。

1.3研究方法

1.3.1血清标本采集：采集观察组术前和对照组体检日清晨空腹静脉血10 ml，离心机12 000 r/min高速离心5 min，取上清液，保存于-80℃的冰箱中待用。

1.3.2血清p53抗体水平检测：取受检者血清标本3 ml，送至中洪博元生物技术有限公司检测血清p53抗体水平，检测药剂(南京森贝伽生物科技有限公司生产)和酶标仪(Olympus， AU600)等均为同一批，检测方法为酶联免疫吸附试验。

1.3.3血清miR-451水平检测：①提取总RNA：取受检者血清标本3 ml，采用miR-451试剂盒(美国 Invitrogen 公司生产)提取总RNA，严格遵循miR-451试剂盒说明书进行操作。RNA经UV1902PC紫外可见分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司生产)测定显示吸光度(A)比值A260/A280在1.7～2.0，提示RNA提取成功。②RNA逆转录成互补DNA(cDNA)：采用逆转录试剂盒(美国 Invitrogen 公司生产)使RNA逆转录成cDNA，严格遵循逆转录试剂盒说明书进行操作。③实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction， PCR)扩增：以cDNA为模板，以微小RNA内参引物(U6)为内参照，应用Tanman universal mmixⅡ试剂盒(上海北诺生物科技有限公司生产)进行实时定量PCR扩增，反应条件为95℃ 15 s变性，50℃ 12 min退火，60℃ 1 min延伸，重复40个循环。miR-451相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。

1.3.4血清CEA水平检测：取受检者血清标本3 ml，应用CEA酶联免疫吸附试验试剂盒(美国R&D公司生产)和酶标仪(郑州安图生物有限公司生产，Phomo)检测血清CEA水平。

2 结果

2.1观察组和对照组血清p53抗体、miR-451和CEA水平比较 观察组血清p53抗体、miR-451和CEA水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 食管鳞状细胞癌患者和健康体检者血清p53抗体、微小RNA-451和癌胚抗原水平比较

2.2食管鳞状细胞癌患者血清p53抗体、miR-451与CEA Spearman相关性分析 Spearman相关性分析结果显示，食管鳞状细胞癌患者血清p53抗体、miR-451与CEA均呈正相关(r=0.711、P<0.001;r=0.719，P<0.001)，见图1和2。

2.3血清p53抗体、miR-451、CEA及3项联合对食管鳞状细胞癌诊断价值 ROC曲线分析结果显示，血清p53抗体、miR-451、CEA及3项联合诊断食管鳞状细胞癌的曲线下面积(AUC)分别为0.953、0.894、0.819、0.966，说明对食管鳞状细胞癌诊断价值血清p53抗体、miR-451和CEA 3项联合检测略高于单独检测；血清p53抗体、miR-451、CEA及3项联合诊断食管鳞状细胞癌的最佳截断值分别为0.225、1.385、10.830 ng/ml和0.538，此时其敏感度和特异度分别为96.6%、84.3%，60.7%、100.0%，50.6%、100.0%和89.9%、88.8%。见图3和表2。

图3 血清p53抗体、微小RNA-451、癌胚抗原及3项联合对食管鳞状细胞癌诊断价值的受试者工作特征曲线

3 讨论

食管癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤，其发生与基因、饮食和环境等都有关，在我国90%以上的食管癌患者为食管鳞状细胞癌，且呈现一定地域差异[6]。有临床研究显示，食管鳞状细胞癌患者预后与治疗时间有关，越早期治疗，预后越好，但食管鳞状细胞癌早期症状不典型，多数患者发现时已经是晚期，严重影响预后[7]。因此，尽早对食管鳞状细胞癌进行诊断，有利于提高治疗效果和改善预后。

表2 血清p53抗体、微小RNA-451、癌胚抗原及3项联合对食管鳞状细胞癌诊断价值的受试者工作特征曲线分析结果

近年来，越来越多的研究显示，除采用肿瘤标志物对肿瘤进行诊断外，不同肿瘤类型可利用一些其他标志物进行诊断[8]。CEA是广泛应用于食管鳞状细胞癌诊断的肿瘤标志物，但敏感度和特异度较低[9-10]。随着临床对癌症诊断的进一步研究，越来越多的学者认为要提高癌症诊断敏感度和特异度，不能仅依靠单一指标，而应该采用多种指标联合检测[11-12]。p53抗体是机体免疫系统对突变型p53蛋白产生自身免疫反应的产物，而突变型p53蛋白是由p53基因突变产生的蛋白。正常情况下，p53基因为人体抑癌基因，能够使癌细胞凋亡，从而预防癌变，同时还可促进缺陷细胞基因修复，但当p53基因发生突变时，其空间结构发生改变，失去抑癌等正常作用，且会由抑癌基因转变为促癌基因[13]。说明p53抗体与肿瘤发生关系密切，其水平越高可能癌变越严重。有研究显示，p53抗体在肺癌、乳腺癌、胃癌和食管癌等恶性肿瘤中均呈现不同程度高表达[14]。本研究结果显示，观察组血清p53抗体水平高于对照组，说明p53抗体在食管鳞状细胞癌患者中高表达。分析其原因可能为食管鳞状细胞癌患者在致癌因素刺激下，多种前癌基因激活，抑癌基因失活，其中p53基因易在此期间发生突变，而突变p53基因不仅不能正常发挥阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定和抑制肿瘤血管等作用，还可转化为促癌基因，加快癌细胞生长和繁殖，从而导致血清p53抗体水平升高[15]。

微小RNA为具有调控功能的非编码RNA，在个体中恒定存在。近年有研究发现，微小RNA的表达与多种癌症有关，可起到类似促癌基因和抑癌基因的作用，但微小RNA具体起何种作用还取决于其下游的靶信使RNA的表达[16]。miR-451属于多功能微小RNA，能参与多种细胞增殖、转移和凋亡等过程，miR-451能与靶信使RNA结合，抑制信使RNA翻译，从而促进细胞凋亡，诱导促癌因子生成，同时能促进癌细胞释放，增加血管内皮通透性，进而促进癌细胞转移、增殖[17]。赵伟和王有礼[18]报道显示，miR-451在胃癌组织中高表达；邢艳丽[4]在关于miR-451的研究中发现，miR-451在食管癌患者血清中高表达，且对食管癌的诊断价值较高。本研究结果显示，观察组血清miR-451水平高于对照组，与上述报道结果类似。本研究Spearman相关性分析结果显示，食管鳞状细胞癌患者血清p53抗体、miR-451与CEA均呈正相关；ROC曲线分析结果显示，血清p53抗体、miR-451、CEA及3项联合诊断食管鳞状细胞癌的AUC分别为0.953、0.894、0.819、0.966，说明对食管鳞状细胞癌诊断价值血清p53抗体、miR-451和CEA 3项联合检测略高于单独检测；血清p53抗体、miR-451、CEA及3项联合诊断食管鳞状细胞癌的最佳截断值分别为0.225、1.385、10.830 ng/ml和0.538，此时其敏感度和特异度分别为96.6%、84.3%，60.7%、100.0%，50.6%、100.0%和89.9%、88.8%。上述结果说明血清p53抗体和miR-451可成为食管鳞状细胞癌新的肿瘤标志物，且血清p53抗体、miR-451和CEA 3项联合检测可提高对食管鳞状细胞癌的诊断价值。

综上所述，食管鳞状细胞癌患者血清p53抗体、miR-451和CEA水平升高，血清p53抗体、miR-451与CEA均呈正相关，对食管鳞状细胞癌诊断价值血清p53抗体、miR-451和CEA 3项联合检测略高于单独检测。然而，本研究也存在一定局限性，主要在于未对p53抗体、miR-451与食管鳞状细胞癌发生机制的关系进行分析，仍需后期进一步探究。