毛志方

江西省人民医院肿瘤科，江西南昌 330006

非小细胞肺癌是全世界范围内最为常见的恶性肿瘤之一，近几十年研究发现，在多数发达及发展中国家中，非小细胞肺癌的发病率及死亡率均呈上升趋势，5年生存率不足20%，每年新发的病例数达130万[1-3]。而且非小细胞肺癌患者在确诊时常处于晚期，治疗效果较差。因此进一步探讨非小细胞肺癌的发病机制，对于非小细胞肺癌的治疗具有重要意义。晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE） 是一种细胞免疫球蛋白，主要以两种形式存在于机体内，可与特异性配体结合，激活细胞内多种信号通路，促使细胞的炎症反应加强，引起机体组织重塑，使肺部发生病理变化，因此与肺部疾病的发生、发展密切相关[4-6]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促进血管生成的重要因子，通过促进血管新生来满足肿瘤的指数生长，并向肿瘤周围浸润转移，因此成为多种恶性肿瘤的判定指标[7-9]。因此，本研究选取10份非小细胞肺癌组织和癌旁组织作为考察对象，探讨非小细胞肺癌组织中RAGE 及VEGF 的表达及相关性，以期为非小细胞肺癌的发病机制阐述及临床治疗提供一定的指导依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年1月～2019年12月江西省人民医院收治的10例非小细胞肺癌患者，每例患者仅取1份组织标本，共取10份非小细胞肺癌组织。患者男7例，女3例；＜50岁2例，≥50岁8例；肿瘤直径＜4.0 cm 患者6例，肿瘤直径≥4.0 cm 患者4例；分化程度：低分化5例，中分化3例，高分化2例。另外收集癌旁正常组织10份（距离肿瘤边缘5 cm）作为对照。本研究经江西省人民医院医学伦理委员会审核及同意。

纳入标准：患者经病理证实为非小细胞肺癌，并签署研究知情同意书。排除标准：合并其他恶性肿瘤患者；合并肝肾功能异常或者心功能不全者；有精神疾病者；有放化疗史者。

1.2 方法

将组织研磨后，按照Trizon 试剂盒提取RNA，采用UV-1600PC型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）测定mRNA 浓度和纯度，后根据HiFi Script cDNA 第一链合成试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，在CFX ConnectR实时荧光定量PCR 仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]上进行检测，以GAPDH为内参，计算出各组RAGE、VEGFa mRNA 的相对表达量。

操作体系：RNase Free dH2O 9.5 μL、cDNA 1 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Rrimer 1 μL、2×qPCR Mixture 12.5 μL，总反应体系25 μL。反应程序，三步法。预变性：95℃、10 min，变性：95℃、10 s，退火：58℃、30 s，延伸：72℃、30 s，40个循环。溶解曲线分析：95℃、15 s，58℃、1 min，95℃、15 s，58℃、15 s，58℃、15 s，95℃、0.5℃。

RAGE、VEGF-a、β-actin 的引物序列、引物长度、产物长度、退火温度情况见表1。

表1 不同引物的引物序列、引物长度、产物长度及退火温度情况

1.3 Realtime PCR 法检测RAGE、VEGF mRNA 的含量

扩增结果利用2-ΔΔCt法进行分析，△△Ct=△Ct 试验-△Ct 对照，△Ct 试验=Ct 目的-Ct 内参，△Ct 对照=Ct 目的-Ct 内参。

1.4 统计学方法

所有数据均采用SPSS 17.0 软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验，不符合正态分布者经过变量转换为正态分布后行统计学分析；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAGE 及VEGF 在非小细胞肺癌组织及癌旁组织中的表达

RAGE mRNA 扩增曲线、溶解曲线见图1，VEGF mRNA 扩增曲线、溶解曲线见图2。

非小细胞肺癌组织中RAGE mRNA 的表达量（0.015±0.009）低于癌旁正常组织（1.000±0.000），差异有统计学意义（P＜0.01），非小细胞肺癌组织中VEGF mRNA 的表达量（4.040±1.650）高于癌旁组织（1.000±0.000），差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 非小细胞肺癌组织中RAGE 及VEGF 相关性分析

经Pearson 相关性分析，非小细胞肺癌组织中RAGE 与VEGF 表达呈负相关（r=-0.654，P＜0.01）。

图1 RAGE mRNA 测定结果

图2 VEGF mRNA 测定结果

3 讨论

RAGE 是一种细胞免疫球蛋白，主要以膜结合形式（mRAGE）和可溶性RAGE（sRAGE）存在于体内，主要定位于Ⅰ型肺泡上皮细胞基底膜，另外内皮细胞、神经细胞、嗜酸性粒细胞、气道平滑肌细胞也均有表达RAGE[8-11]。研究发现，RAGE 在胚胎发育期的多种组织中高表达，成年后在除肺组织以外的其他组织中均低表达[10-11]。另外有研究表明，在肿瘤、神经退行性疾病、糖尿病、血管疾病等疾病中，RAGE 均高表达[10-11]，而在哮喘、肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、支气管肺发育不良、间质性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病及肺癌中低表达[12-13]。有研究结果显示，RAGE 在非小细胞肺癌组织中蛋白及mRNA 表达量均下调，而且与肿瘤的TNM 分期、组织学类型相关，且过表达RAGE 可以使非小细胞肺癌细胞生长受限制，并诱导细胞凋亡[14-16]。本研究结果与以往报道结果一致[14]在非小细胞肺癌组织中，RAGE mRNA 表达量低于癌旁正常组织，提示RAGE 在非小细胞肺癌的发生、发展过程起着抑癌作用，与在其他肿瘤中的表达趋势不同，原因可能在于RAGE 作为正常肺组织细胞膜上的受体，与肺泡的结构、形态、分化及功能密切相关。RAGE 表达量的下调不仅仅干扰了肺泡细胞的结构功能，也引发了肺部肿瘤的形成；也有可能是非小细胞肺癌细胞属于支气管上皮细胞，此类型细胞不表达RAGE，当RAGE 表达量明显降低，可能会促进此类型细胞增殖，进一步诱导为癌细胞。

肿瘤的发生发展涉及癌细胞的生长、凋亡、迁移、侵袭及血管生成等多个复杂的过程，其中血管生成在肿瘤的生长及转移过程起着重要作用。血管生成是一个涉及细胞外基底膜降解、内皮细胞迁移、增殖等复杂步骤的过程，整个过程涉及多种生长因子及细胞因子的调控作用，VEGF 是目前已知的血管生长因子中最强、特异性最高的一个。VEGF 不仅可以通过特异性结合于血管内皮细胞上的受体来发挥其生物学效应[17-18]，还可以通过其自身磷酸化、诱导细胞外基质降解、增加血管通透性进而发挥其促血管生成作用[19-20]。目前针对VEGF 抑制剂的研究已经被广泛应用于临床研究。本研究Realtime PCR 结果显示，在非小细胞肺癌组织中，VEGF mRNA 表达量高于癌旁正常组织，与大部分学者的研究结果一致[21-22]，说明VEGF 促进非小细胞肺癌的发生发展。

另外本研究通过Pearson 相关性分析，结果显示，非小细胞肺癌组织中的RAGE 与VEGF 表达呈负相关（r=-0.654，P＜0.01）。RAGE 的DNA 适体能够降低对G361 裸鼠黑色素瘤8-羟基-2′-脱氧鸟苷、AGEs、RAGE、增殖核抗原、细胞周期蛋白D1、VEGF、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、CD31 和Mac-3 的水平，RAGE适体通过抑制AGE-RAGE 系统抑制肿瘤血管生成和巨噬细胞浸润，从而抑制裸鼠黑色素瘤的生长和肝转移[23]。RAGE 通过激活RAGE/NF-κB 通路诱导人滑膜细胞VEGF 生成及炎症反应[24]。说明RAGE 可能能够通过靶向VEGF 影响非小细胞肺癌的恶性生物学行为，成为非小细胞肺癌基因治疗的新靶点之一。

综上所述，RAGE 在非小细胞肺癌中低表达，VEGF 在非小细胞肺癌中高表达，而且非小细胞肺癌组织中RAGE 与VEGF 表达呈负相关。但由于标本数目的限制，目前尚未进一步探讨RAGE、VEGF 与非小细胞肺癌患者临床病理参数的关系，因此本研究未来将对RAGE、VEGF 在肺癌（包括非小细胞、小细胞以及其他病理类型）的发生发展过程中的关系及作用，进行进一步的探讨。