施景龙 李 博 贺 欢 宋向晖

1.广州市第十二人民医院普通外科，广东广州 510630；2.广东省第二人民医院消化内科，广东广州 510317；3.广东省妇幼保健院ICU，广东广州 510000

胰腺癌是消化系统肿瘤疾病之一，其起病隐匿且病情发展较快，疾病恶性程度高，患者死亡率亦较高，是导致我国消化系统肿瘤疾病致死的主要原因之一[1]。近年来随着肿瘤研究的展开，肿瘤发生、发展、浸润、转移等多项过程中相关基因在肿瘤病情评估和预后预测的研究成为热点。上皮间质转化（EMT）与胰腺癌发生发展密切相关，而E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）等为EMT 相关蛋白，亦可参与胰腺癌发生发展[2]。通过上调转化生长因子β1（TGF-β1）可促进EMT 从而促进癌细胞转移[3-4]。TGF-β1 和EMT 相关蛋白均可能与胰腺癌侵袭转移相关，但目前关于胰腺癌组织中TGF-β1、EMT 相关蛋白表达水平及其与侵袭转移关系研究仍较少。因此，本研究检测胰腺癌组织TGF-β1 和EMT 相关蛋白的表达水平，并分析其与病情以及肿瘤侵袭的关系，旨在为胰腺癌侵袭转移防治提供新思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月～2020年2月广东省第二人民医院消化内科（32例）和广州市第十二人民医院普通外科（28例）收治的60例胰腺癌患者作为研究对象。纳入标准：①患者均经影像学和病理学检查确诊为胰腺癌，首次确诊；②预计存活期在3个月以上；③行胰腺癌根治手术；④知情同意。排除标准：①入院前经抗癌治疗或合并手术禁忌证；②合并肿瘤转移或其他肿瘤疾病患者；③合并肝肾功能障碍患者；④合并心脑血疾病患者；⑤妊娠期或哺乳期女性；⑥精神状态异常患者。60例胰腺癌患者中，男35例，女25例；年龄45～76岁，平均（60.52±13.73）岁；高分化癌28例，低分化癌32例；肿瘤部位位于胰头33例，胰体20例，胰尾7例；合并淋巴结转移27例；肿瘤直径＜2 cm 7例，2～4 cm 28例，＞4 cm 25例。所有患者及其家属均知情同意，且本研究经医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 试剂和仪器

即用型SABC 免疫组织化学染色试剂盒、鼠抗人Vimentin 单克隆抗体、鼠抗人E-cadherin 单克隆抗体及鼠抗人TGF-β1 单克隆抗体均购自南京凯基公司，工作浓度1∶100，SW-CY-1F型净化工作台购自苏州净化设备厂，微量移液器均购自德国Eppendorf 公司，倒置显微镜购自日本Nikon 公司，低温冰箱购自山东青岛海尔公司，Model550 酶标仪购自美国BIORAD公司，糖类抗原（CA）199和CA242 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海赛默生物科技发展有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 免疫组织化学染色检测 以手术获取的胰腺癌组织和癌旁组织为待检测标本，免疫组织化学染色法检测胰腺癌组织和癌旁组织的TGF-β1 以及E-cadherin、Vimentin 等EMT 相关蛋白阳性表达率。待检测样本经福尔马林固定和石蜡包埋切制成厚度为4 μm连续切片，二甲苯浸泡10 min 脱蜡，梯度酒精脱水去除二甲苯，3%过氧化氢溶液进行内源性过氧化物酶的灭活，柠檬酸工作液加热行抗原热修复，添加40 μL 相应一抗，室温（20℃）下孵育1 h，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤3 遍，添加40 μL 相应二抗，室温下孵育0.5 h，PBS 洗涤3 遍，DAB 显色2 min后显微镜下观察，显色满意后以清水终止反应，行苏木精复染，返蓝，脱水，透明，吹干并以中性树脂封片。随机选取3个视野（400×）进行观察，TGF-β1、Vimentin 表达定位于细胞质，E-cadherin 表达定位于细胞膜，以出现棕黄色、棕褐色或黄色颗粒为表达阳性，以阳性细胞＜10%为阴性，阳性细胞≥10%为阳性，统计阳性表达率。

1.3.2 酶联免疫检测 入组次日患者均取空腹肘静脉血3 mL检测血清CA199和CA242水平，血液样本采集采用一次性针管和不含热原和内毒素试管，1500 r/min、3 cm 半径、4℃环境中离心10 min，待分层后收集上层血清在-20℃低温冰箱冷藏待测。CA199和CA242 ELISA 试剂盒固相包被板在室温（20℃）下平衡约20 min，设立标准品孔与样品孔，不同浓度的标准品50 μL 分别加入标准品孔，取待测样本10 μL 和样本稀释液40 μL 先后加入样本孔，标准品孔与样品孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL 并在37℃水浴恒温箱孵育1 h，弃去反应液并吸水纸上拍干，洗涤，每孔中均加入显色剂A、B 各50 μL，轻轻摇晃混匀后在37℃恒温箱中避光孵育15 min，每孔中均加入终止液50 μL，15 min 内在450 nm 波长处测量各孔的吸光度（OD）值，制作标准曲线并根据标准曲线和样本吸光度计算样本浓度。

1.3.3 淋巴结转移、浸润分期状况检测 采用PhilipsIE33型超声仪、3.5～6 MHz 探头频率常规行超声检查，观察胰腺肿瘤形态、回声、阴影状况以及边界模糊情况，行常规淋巴结扫描，对可疑淋巴结转移部位取样行病理检查，确定淋巴结转移、浸润分期状况，采用美国癌症联合委员会（AJCC）第8版TNM 分期[5]中的淋巴结转移、浸润分期标准。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验；Kendall 相关法分析胰腺癌组织TGF-β1 和EMT 相关蛋白表达与其血清CA199和CA242水平、淋巴结转移、浸润分期的关系，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰腺癌组织与癌旁组织中TGF-β1 和EMT 相关蛋白表达水平的比较

以出现棕黄色、棕褐色或黄色颗粒为表达阳性，TGF-β1、Vimentin 表达于细胞质而E-cadherin 表达于细胞膜。胰腺癌组织细胞中TGF-β1 和Vimentin阳性表达细胞数占多数，仅有少数胰腺癌组织细胞为E-cadherin阳性表达；而在癌旁组织细胞中仅有少量细胞为TGF-β1 或Vimentin阳性表达，而E-cadherin阳性表达细胞数占多数（图1～2，封三）。与癌旁组织比较，胰腺癌组织中TGF-β1 和Vimentin阳性表达率升高而E-cadherin 的阳性表达率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

图1 TGF-β1、E-cadherin、Vimentin 在胰腺癌组织中的表达（免疫组织化学染色法，400×）

图2 TGF-β1、E-cadherin、Vimentin 在癌旁组织中的表达（免疫组织化学染色法，400×）

表1 胰腺癌组织与癌旁组织中TGF-β1 和EMT 相关蛋白表达水平的比较[n=60，n（%）]

2.2 不同胰腺癌组织TGF-β1 和EMT 相关蛋白表达水平患者血清CA199和CA242水平、淋巴结转移率、浸润分期的比较

TGF-β1 阳性表达患者的血清CA199和CA242水平、淋巴结转移率、浸润分期为T3～T4期比例均高于其阴性表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；E-cadherin阳性表达患者的血清CA199和CA242水平、淋巴结转移率、浸润分期为T3～T4期比例均低于其阴性表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；Vimentin阳性表达患者的血清CA199和CA242水平、淋巴结转移率、浸润分期为T3～T4期比例均高于其阴性表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 不同胰腺癌组织TGF-β1 和EMT 相关蛋白表达水平患者血清CA199和CA242水平、淋巴结转移率、浸润分期的比较

2.3 胰腺癌组织TGF-β1 和EMT 相关蛋白表达水平与其血清CA199和CA242水平、淋巴结转移率、浸润分期的关系分析

Kendall 相关分析结果显示，胰腺癌组织TGF-β1和Vimentin阳性表达率与其血清CA199和CA242水平、淋巴结转移率、浸润分期均呈正相关（TGF-β1：r=0.786、0.835、0.882、0.874，P＜0.05；Vimentin：r=0.757、0.792、0.808、0.849，P＜0.05），而胰腺癌组织E-cadherin阳性表达率与其血清CA199和CA242水平、淋巴结转移率、浸润分期均呈负相关（r=-0.842、-0.889、-0.818、-0.793，P＜0.05）。

3 讨论

胰腺癌是临床常见恶性肿瘤，好发于男性人群，发病率近年来呈现不断上升的趋势，其早期症状隐匿均无明显的特异性，早期确诊困难，且病情发展迅速，死亡率较高[6-8]。侵袭转移是胰腺癌患者病情恶化和患者死亡的重要原因[9-12]。本研究中，近一半的确诊胰腺癌患者出现了淋巴结转移而浸润分期为T3～T4期，而血清CA199和CA242水平明显较高，其侵袭转移明显，需对其侵袭转移进行有效预防和控制以缓解病情，改善疗效和预后。近年来，肿瘤研究开展较多，肿瘤相关基因和蛋白表达检测在肿瘤病情和预后评估中应用成为热门。

TGF-β1 参与肿瘤的细胞增殖、分化调节、胚胎发育调节、促进细胞外基质形成以及免疫反应调节等多个过程，在肿瘤疾病早期具有肿瘤抑制因子的作用，而随着肿瘤发展，TGF-β1 对肿瘤细胞的抑制作用失效，反而可刺激肿瘤血管生成、细胞外基质合成、抑制免疫并促进肿瘤细胞转移[13-16]。本研究中，胰腺癌组织中TGF-β1 阳性表达率高于其癌旁组织（P＜0.05），证实TGF-β1 在胰腺癌肿瘤发生发展中可能具有促进作用；TGF-β1 阳性表达患者的血清CA199和CA242水平、淋巴结转移率、浸润分期为T3～T4期比例均高于其阴性表达患者（P＜0.05）；相关分析结果显示，胰腺癌组织TGF-β1 表达与其血清CA199和CA242水平、淋巴结转移、浸润分期均密切相关，可能促进胰腺癌侵袭转移，TGF-β1 在胰腺癌组织中表达水平的检测可能用于胰腺癌肿瘤侵袭转移评估。EMT 在胰腺癌等肿瘤疾病演进中扮演重要角色，EMT 具有上皮细胞极性丧失和间质特征，可下调E-cadherin 等上皮细胞性标志物并上调Vimentin 等间质性标志物，从而促进肿瘤侵袭转移[17-19]。本研究中，胰腺癌组织中E-cadherin阳性表达率降低而Vimentin阳性表达率升高，提示EMT 在胰腺癌发展中可能具有促进作用，这与Krebs 等[20]研究的Zeb1 激活EMT 促进胰腺癌的转移结论以及Sheng 等[21]研究的促进EGF 诱导的胰腺癌细胞EMT 可促进胰腺癌的发生发展结论一致。E-cadherin、Vimentin阳性表达患者的血清CA199和CA242水平、淋巴结转移率、浸润分期为T3～T4期比例与其阴性表达患者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；Kendall 相关分析提示，胰腺癌腺癌组织E-cadherin和Vimentin阳性表达率与其血清CA199和CA242水平、淋巴结转移率、浸润分期均密切相关，EMT 可能促进胰腺癌侵袭转移，E-cadherin、Vimentin 等EMT相关蛋白在胰腺癌组织中表达水平的检测可能用于胰腺癌肿瘤侵袭转移评估。而对TGF-β1 以及EMT干预可能为胰腺癌防治的有效措施。

综上所述，胰腺癌组织TGF-β1、Vimentin、E-cadherin 表达均与肿瘤侵袭转移密切相关，可能用于胰腺癌侵袭转移评估。