肖毅力，张宝月，张亚红，宋正己

1昆明理工大学医学院，昆明650500；2云南省第一人民医院

肝纤维化是所有慢性肝病发展为肝硬化必经的病理过程，是各种慢性肝病损伤修复过程的共同结果，并与肝癌的发生有关。肝纤维化发生的关键因素是肝星状细胞（HSC）的增殖和活化［1］，活化的HSC是肝组织中细胞外基质（ECM）的主要来源［2］，对HSC增殖与活化的抑制一直是抗肝纤维化研究的核心。在慢性肝损伤时，HSC激活表型转化为表达α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）［3］。HSC的活化由许多炎症细胞因子和生长因子介导，包括结缔组织生长因子和转化生长因子β1（TGF-β1）。TGF-β1是从HSC产生ECM的主要刺激物，且在纤维发生过程中表达增加［4-5］。此外，研究表明，持续的 Wnt/βcatenin通路激活与肺脏、肝脏、肾脏及皮肤纤维化等的发病机制有关［6］。Frizzled-4是Wnt/β-catenin信号通路的关键受体蛋白，Frizzled-4的表达量直接影响细胞内β-catenin水平，β-catenin的核内累积是Wnt信号通路活化的重要标志［7］。灵芝是中国传统药物，具有抗肿瘤、抗氧化、保肝等作用；白灵芝属于灵芝的一种，为中国西南地区特有品种。2017年6月—2019年2月，我们观察了白灵芝提取物（GLE）对大鼠HSC增殖、活化的影响，并探讨其是否与Wnt/β-catenin信号通路有关，以期为防治肝纤维化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 GLE由云南农业科学院昆虫生物医药研发重点实验室提供，于-20℃冰箱保存；大鼠HSC-T6购自中国科学院昆明动物所细胞库。青霉素—链霉素双抗（BI公司），CCK8（碧云天），特级胎牛血清（美国GIBCO），DMEM高糖培养基（BI公司）；一抗GAPDH、Frizzled-4、β-catenin抗体（英国Abcam），二抗兔抗兔（CELL SIGNALING），SDSPAGE凝胶试剂盒（碧云天），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天），Chemidoc XRS成像系统（BIORAD），Trans-blot电泳槽组件（BIO-RAD）；SYBR荧光染料试剂盒（TAKALA公司），总RNA提取试剂盒（天根），Master Mix（TAKALA）实时荧光定量PCR仪（Aglient），超微核酸定量检测仪（BIO-TEK）。

1.2 HSC-T6细胞培养 将复苏后的HSC-T6接种于含10%胎牛血清DMEM高糖培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中培养并传代备用。在生物安全柜中用胰酶消化HSC-T6，用培养基配成5×105/mL的细胞悬液；将HSC悬液接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100 μL；轻摇培养板以保证铺板均匀，将铺好的96孔板于恒温培养箱中培养过夜。

1.3 GLE溶液制备 临用前夜将GLE转入4℃冰箱缓慢解冻，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释5倍；以0.22 μm微孔滤器过滤后，继续用上述培养基分别稀释10、25、50、100、200倍备用。

1.4 HSC-T6细胞增殖情况观察及GLE作用时间、浓度筛选 在显微镜下观察细胞贴壁后，吸出孔板中的培养基；GLE组将稀释好的GLE加入96孔板中，每孔100 μL，每个浓度均设置6个复孔；对照组加100 μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。左右轻微摇晃后，将96孔板放入恒温培养箱中培养。分别于培养24、48、72 h，每孔加入CCK8溶液10 μL，在37℃恒温箱孵育2～4 h。采用酶标仪在450 nm波长处测定各孔OD值，各复孔OD值取平均数，以此表示细胞增殖情况；OD值越小，则抑制作用越强；选择与对照组有统计学差异的干预时间，作为后续研究的作用时间。根据药物各浓度组的细胞增殖抑制率计算GLE干预的半数抑制浓度（IC50），选择小于该浓度的GLE进行后续实验干预。增殖抑制率=（对照孔OD值-实验孔OD值）/对照孔OD值×100%。

1.5 HSC-T6细胞活化情况观察 将对数生长期的HSC接种于6孔板，于培养箱中培养24 h后弃去上清液；干预组加入1.4筛选浓度的GLE 1.5 mL于6孔板中，对照组加入等体积的完全培养基，继续培养48 h。加入裂解液RZ，用移液器不断吸取裂解液并吹打孔板中的细胞，使细胞被充分、均匀裂解。根据总RNA提取试剂盒说明提取RNA备用，按照逆转录试剂盒配制20 μL的逆转录反应体系得到cDNA，参考试剂盒说明书将cDNA进行实时荧光定量PCR。以GAPDH为内参，按照2－ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。引物序列：α-SMA上游为5′-TGGTATTGTGCTGGACTCTG-3′，下游为5′-CCATCAGGCAGTTCGTAG-3′；TGF-β1上游为5′-CCCGCATCCCAGGACCTCTCT-3′，下游为5′-CGGGGGACTGGCGAGCCTTAG-3′；内参 GAPDH上游为 5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游为5′-CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU-3′。

1.6 HSC-T6细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白检测 将HSC-T6配置成1×105/mL的细胞悬液，以每孔1.5 mL接种于6孔板中；待细胞融合至80%左右，干预组每孔加入1.4筛选浓度的GLE 1.5 mL，对照组每孔加入等量含10%胎牛血清DMEM高糖培养基；每组设3个复孔，培育48 h。用含有PMSF的细胞裂解液提取总蛋白，采用Western blotting法以GAPDH为内参测算β-catenin、Frizzled-4蛋白表达量，以此表示信号通路活性。

1.7 统计学方法 采用GraphPad Prism7统计软件。计量资料以表示，数据比较采用方差分析或t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GLE对HSC-T6细胞增殖的影响及作用时间、浓度筛选结果 由表1可见，随着GLE浓度增加及干预时间延长，HSC-T6细胞增殖的OD值逐渐降低；与对照组比较，干预24 h时差异无统计学意义，干预48、72 h时差异具有统计学意义（P均＜0.05），故选择48 h作为后续研究的作用时间。GLE组在稀释200、100、50、25、10倍时，干预24 h的增殖抑制率分别为6.647%、5.766%、6.266%、6.997%、9.690%，干预48 h的细胞增殖抑制率分别为28.509%、51.695%、63.139%、65.763%、69.876%，干预72 h的细胞增殖抑制率分别为25.676%、43.266%、67.325%、82.339%、82.224%。GLE干预48 h时的IC50约为GLE稀释100倍，后续实验采用稀释200倍为GLE作用浓度。

表1 GLE对HSC-T6细胞增殖的影响（）

表1 GLE对HSC-T6细胞增殖的影响（）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

images/BZ_46_234_1605_1193_1664.png GLE组稀释10倍稀释25倍稀释50倍稀释100倍稀释200倍对照组0.414±0.027*0.411±0.062*0.761±0.130*1.321±0.240*1.731±0.150*2.330±0.067 3.007±0.085 3.097±0.078 3.121±0.073 3.183±0.083 3.109±0.012 3.330±0.133 0.945±0.141*1.074±0.024*1.156±0.111*1.515±0.042*2.243±0.253*3.137±0.033

2.2 GLE对HSC-T6细胞活化的影响 干扰组HSC-T6细胞α-SMA、TGF-β1mRNA相对表达量分别为0.77± 0.23、0.86± 0.15，对照组均为1，干扰组α-SMA、TGF-β1mRNA表达均低于对照组（P均＜0.05）。

2.3 GLE对HSC-T6细胞Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响 干扰组HSC-T6细胞Wnt/β-catenin信号通路蛋白Frizzled-4、β-catenin表达量分别为0.81±0.13、0.63±0.17，分别低于对照组的0.96± 0.16、0.84 ± 0.22（P均＜0.05）。

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝损伤愈合反应后的结果，是一个损伤修复的动态过程。其特征在于不同因素（病毒、自身免疫、药物诱导、胆汁淤积和代谢疾病等）引起的慢性肝损伤组织中ECM增多并伴有病理性血管新生［8-9］，可造成门静脉高压、肝脾肿大、肝功能紊乱甚至衰竭。慢性肝炎病毒感染和长期接触有毒物质如乙醇等可诱发肝细胞坏死和细胞凋亡，细胞坏死和细胞凋亡会激活静止HSC，触发肝脏修复机制使ECM分泌增加，最终导致肝内纤维生成和降解失衡，过多的胶原在肝内沉积［3，10］。

HSC由静息变为激活表型，由维生素A储存细胞转分化为增殖性、收缩性增加的肌成纤维细胞，活化HSC现已成为实验和临床肝纤维化干预的主要靶细胞［11］。在慢性肝损伤期间，HSC激活成表达α-SMA具有收缩性的肌成纤维细胞，HSC表型从脂肪储存细胞转变为肌成纤维细胞，脂滴逐渐减少或消失，细胞增殖和细胞收缩迁移能力增加，导致肝内血管扭曲和血管阻力增加，从而促进门静脉高压症形成［12-13］。TGF-β有 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β33 种同种亚型，是与ECM相关且研究最深入的细胞因子之一。TGF-β1是促进纤维化的主要因子，能够通过跨膜受体发挥作用，可调节包括Ⅰ型、Ⅲ型前胶原在内的ECM分泌相关靶基因的转录［14］。因此，TGF-β1对HSC的活化作用是肝纤维化形成和发展的中心环节。在各种因素刺激下（肝炎病毒、乙醇、各种抗原等），TGF-β1/Smads信号通路可激活HSC并促进其分泌大量ECM沉积在肝脏［4-5］。另外，有研究表明，TGF-β1能够介导Wnt/β-catenin信号通路的激活［15］，而经典Wnt/β-catenin信号通路的激活有调节细胞增殖、存活和细胞行为的功能。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在HSC的增殖、分化、分裂、迁移和凋亡中起重要作用。该通路的异常激活可诱导肝纤维化，阻断Wnt/β-catenin信号通路是治疗肝纤维化的关键方法之一［16-17］。β-catenin蛋白是经典Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白，在没有Wnt信号的情况下其会被磷酸化并降解。然而，当Wnt蛋白与Frizzled家族蛋白和单个跨膜脂蛋白受体相关蛋白（LPR）5或6共受体的异二聚体受体复合物结合时，可导致下游蛋白β-catenin抑制复合体GSK-3、APC、CK1等的合成被抑制，β-catenin在胞质内大量累积，信号传达到细胞核中与淋巴增强因子/T细胞因子（LEF/TCF）结合，进而影响细胞生命活动［7］。

灵芝为古称的“九大仙药”之一，最早的中药典籍《神农本草经》中即有收载。灵芝中含有丰富的多糖、三萜类、肽类、核苷生物碱、氨基酸以及多种微量元素，是其产生临床疗效的重要物质基础。灵芝及其提取物对多种有毒物质、免疫、缺血等因素造成的肝损伤均有抑制作用，在抑制肝纤维化、减轻脂肪肝形成等方面也具有良好的作用趋势，还有一定的抗肿瘤、抗衰老、降血糖作用［18-19］。白灵芝又名白肉灵芝、玉芝，辛平无毒，主治咳逆上气，益肺气，通利口鼻，强志意，安魄。目前，市场上常见的白灵芝有云南白灵芝和西藏白灵芝［20］。朱优优［21］发现，白灵芝相较于赤灵芝、云灵芝等其他灵芝品种，具有更高的灵芝多糖含量。灵芝多糖是灵芝最主要的化学成分之一，具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等多种功效［19］。

本研究结果显示，与对照组比较，GLE组能不同程度抑制HSC增殖，抑制作用与作用时间及剂量有关。在慢性肝损伤期间，HSC激活成表达α-SMA具有收缩性的肌成纤维细胞，并分泌TGF-β1。本研究发现，GLE能在核酸水平下调α-SMA和TGF-β1的表达，表明其对于HSC的活化有一定的抑制作用。TGF-β1对HSC细胞ECM的分泌和活化有刺激作用，对TGF-β1的抑制能够减缓肝纤维化的进程。此外，GLE还能下调Wnt/β-catenin信号通路活化，抑制关键蛋白β-catenin和Frizzled-4的表达，其对肝纤维化进程的抑制可能与此通路的阻断有关，但其具体作用机制还需进一步探究。