张蕊，蒋磊，王志贤

安徽省第二人民医院，合肥230041

细胞焦亡是细胞程序性死亡的一种，是指细胞 受到某些信号因子刺激，导致细胞主动消亡的病理生理过程。既往研究认为，细胞焦亡的形成机制可分为Caspase-1介导的经典型细胞焦亡和Caspase-4/5/11介导的非经典型细胞焦亡［1-2］。近年研究显示，Caspase-3/焦孔素E（GSDME）细胞焦亡途径在恶性肿瘤中发挥重要作用。焦孔素（GSDMs）是一个具有成孔效应的蛋白家族，能影响细胞膜通透性和细胞焦亡。GSDMs可与脂质结合，在细胞膜形成小孔，诱导细胞焦亡［1］。GSDME是GSDMs家族成员之一，其分子结构由两个保守的结构域组成，即C-末端抑制结构域和N-末端效应结构域，其中N端具有细胞毒性。GSDME能够被活化的Caspase-3（Cleaved Caspase-3）剪切，形成具有细胞成孔作用的片段GSDME-N，导致细胞内容物如乳酸脱氢酶（LDH）、白细胞介素1β（IL-1β）、IL-18等释放，诱导细胞强烈的炎症反应［3］。研究表明，细胞焦亡参与了心血管疾病的发生发展。多柔比星（Dox）是一种蒽环类抗生素，广泛用于肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤的化疗，心脏毒性是其主要不良反应［4］。目前，有关Dox导致心脏毒性的具体分子作用机制尚不完全清楚。2018年12月—2019年12月，我们观察了Dox对大鼠心肌细胞H9c2焦亡的影响，探讨其心脏毒性作用是否与Caspase-3/GSDME信号通路有关。

1 材料与方法

1.1 主要材料 H9c2细胞（美国ATCC公司），高糖DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司）；多柔比星（Sigma公司）；DAPI细胞核染料（江苏碧云天公司），Cleaved Caspase-3一抗（Cell Signaling Technology公司），GSDME-N一抗（Abcam公司），IL-1β、IL-18一抗（Proteintech公司）；细胞转染试剂盒、GSDME siRNA干扰片段（广州锐博公司），CCK-8检测试剂盒、碘化丙啶检测试剂盒（江苏碧云天公司），LDH试剂盒（江苏碧云天公司），IL-1β、IL-18 ELISA试剂盒（北京中杉金桥公司）。多功能酶标仪（Thermo Fisher），高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器有限公司），荧光倒置显微镜（Olympus），PCR仪、Western blotting检测装置（Bio-Rad公司）。

1.2 细胞培养与分组处理 向H9c2细胞中加入高糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，隔天换液。加入胰蛋白酶消化、吹打混匀，种植于6孔板内；贴壁生长24 h后，倾去细胞培养基。将细胞分为空白对照组、Dox组、GSDME转染对照组和GSDME干扰组。空白对照组：加入高糖DMEM培养基培养；Dox组：加入4 μmol/L Dox培养8 h；而GSDME转染对照组：转染GSDME siRNA对照无干扰序列24 h后，加入Dox培养8 h；GSDME干扰组：转染GSDME siRNA 24 h后，加入Dox培养8 h。

1.3 细胞焦亡情况观察 采用碘化丙丁（PI）细胞染色法。收集各组细胞，加入4%多聚甲醛固定，PBS洗涤。避光条件下，加入PI染色液，室温染色15 min。倾去PI染色液，避光条件下加入DAPI染色3～5 min，PBS洗涤。荧光倒置显微镜下观察细胞染色情况并拍照，以PI阳性细胞率表示细胞焦亡情况。PI阳性细胞率越高，细胞焦亡发生率越高。

1.4 细胞中LDH、IL-1β、IL-18释放情况观察 收集各组细胞，离心收集上清液；采用比色法检测LDH释放量，ELISA法检测IL-1β、IL-18水平。上酶标仪测定吸光度值，计算LDH释放量。释放量=（处理样品吸光度值-空白对照吸光度值）/（全部释放量孔吸光度值-空白对照吸光度值）×100%。

1.5 细胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表达检测 采用Western blotting法。将H9c2细胞离心后置于1.5 mL的EP管内，按照1∶3～1∶5加入细胞裂解液并充分震荡裂解；用高速离心机4℃下以12 000 g离心15 min，收集细胞上清液，采用BCA法检测蛋白质浓度。取40 μg蛋白上样，行蛋白质凝胶电泳；湿转转膜法将蛋白转移至PVDF膜上，脱脂牛奶封闭2 h。加入相应的一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；加入二抗（1∶5 000），孵育1 h。TPBS洗涤，加入发光聚合物（ECL）；使用胶片曝光，将图片扫描后用Image J软件测定各条带灰度值，以目的蛋白条带与内参β-actin灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。结果以-x±s表示，多组间比较采用ANOVA分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组PI阳性细胞率比较 空白对照组、Dox组、GSDME转染对照组、GSDME干扰组PI阳性细胞率分别为10.85%±1.25%、65.50%±8.50%、62.89%±8.89%、30.21%±7.50%，Dox组、GSDME转染对照组＞GSDME干扰组＞空白对照组（P均＜0.05），Dox组与GSDME转染对照组差异无统计学意义。

2.2 各组细胞中LDH、IL-1β、IL-18释放情况比较 细胞中LDH、IL-1β、IL-18释放量Dox组、GSDME转染对照组＞GSDME干扰组＞空白对照组（P均＜0.05），Dox组与GSDME转染对照组差异无统计学意义。见表1。

表1 各组细胞LDH、IL-1β、IL-18释放情况比较（）

表1 各组细胞LDH、IL-1β、IL-18释放情况比较（）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与Dox组比较，#P＜0.05。

images/BZ_28_234_402_1193_465.png空白对照组Dox组GSDME转染对照组GSDME干扰组50.80±11.21 85.41±18.20*85.44±20.21*60.12±10.21#10.21±2.50 40.80±8.50*41.00±8.95*15.85±6.21#12.50± 2.59 35.21± 8.60*34.50±10.01*21.21± 7.50#

2.3 各组细胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表达比较 与空白对照组比较，Dox组、GSDME转染对照组细胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表达均升高（P均＜0.05）；与Dox组比较，GSDME干扰组GSDME-N蛋白表达降低（P＜0.05），GSDME转染对照组各指标差异无统计学意义。见表2。

表2 各组细胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N、IL-1β、IL-18蛋白表达比较（-x± s）

3 讨论

Dox在有效抗肿瘤过程中，常伴随严重的心脏毒性。研究发现，Dox静脉注射后可迅速分布在心、肾、肝和肺等组织，而心脏组织中药物的消除半衰期明显高于其他组织［5］。有效解决Dox长时间滞留于心脏引发的心脏毒性，可为临床合理使用Dox提供参考依据。研究发现，活性氧（ROS）过度产生是Dox造成心脏毒性的重要分子机制之一。ROS可以通过升高脂质过氧化产物，继而导致心脏毒性［6］。线粒体损伤在Dox诱导的心脏毒性中同样发挥重要作用，线粒体损伤可以导致ROS过量产生以及细胞色素C释放增多［7］。此外，Dox还可诱导一氧化氮合酶高表达，释放一氧化氮，促使心肌功能酶失活，导致心肌损伤［8］。

新近研究表明，细胞焦亡广泛参与了心血管疾病的发生发展。细胞焦亡在形成机制和死亡形态上不同于以往其他类型细胞死亡，包括凋亡和细胞坏死［9-10］。以往文献证实，细胞焦亡以细胞膜破裂为特征，PI染色剂可以通过破损细胞膜进入细胞核进而染色，而凋亡的细胞膜完整则无法通过，因此本文以细胞PI染色阳性表示细胞焦亡情况。本研究结果显示，与空白对照组比较，Dox组PI阳性细胞率升高，表明Dox造成了心肌细胞焦亡；与Dox组比较，GSDME干扰组PI阳性细胞率降低，这表明干扰GSDME能有效抑制Dox诱导的细胞焦亡。LDH是活细胞胞质内含酶之一，在正常生理状态下不能透过细胞膜；当靶细胞受损时，细胞膜通透性改变，LDH可以释放至介质中。因此，细胞上清液中LDH含量可以反映细胞膜破损情况。IL-1β和IL-18是细胞焦亡发生时诱导炎症的关键因子，其可通过细胞小孔释放至细胞外诱导炎症风暴。因此，细胞膜外IL-1β和IL-18水平可以反映细胞损伤以及炎症状况。本研究结果显示，与空白对照组比较，Dox组细胞中LDH、IL-1β、IL-18释放量均增加，表明Dox造成了细胞膜损伤，导致IL-1β、IL-18释放，从而诱发细胞焦亡；与Dox组比较，GSDME干扰组细胞中LDH、IL-1β、IL-18释放量降低，表明干扰GSDME能够有效抑制Dox造成的细胞损伤以及炎症反应。

在肿瘤细胞焦亡中，Caspase-3/GSDME依赖性细胞焦亡途径发挥重要作用。Caspase-3是与细胞凋亡相关的关键蛋白，Cleaved Capase-3能够诱导细胞凋亡，导致细胞功能紊乱［11］。GSDME是非经典细胞焦亡的关键蛋白，细胞高表达GSDME时，Cleaved Caspase-3亦可诱导 GSDME 依赖的细胞焦亡［12］。ZHANG等［13］报道，在肺癌A549细胞中，紫杉醇和顺铂能激活Caspase-3形成Cleaved Caspase-3，进而激活GSDME-N并诱导细胞焦亡。在胃癌细胞中，Dox能通过激活Caspase-3/GSDME途径诱导肿瘤细胞焦亡［14］。在乳鼠心肌细胞中，Dox能通过活化Caspase-3和PARP-1，诱导心肌细胞凋亡［15］。高智明［16］研究发现，Dox能上调Cleaved Caspase-3表达，诱导大鼠心肌细胞肥大以及细胞凋亡，导致心肌损伤。本研究结果显示，与空白对照组比较，Dox组细胞Cleaved Caspase-3、GSDME-N 及 IL-1β、IL-18蛋白表达升高；与Dox组比较，GSDME干扰组GSDME、GSDME-N蛋白表达显著降低，但是Caspase-3、Cleaved Caspase-3、IL-18、IL-1β蛋白无显著变化，这表明Dox是通过GSDME依赖性途径诱导的细胞焦亡。Caspase-3介导的下游信号GSDME依赖性细胞焦亡是独立于细胞凋亡的一种新的死亡方式，通过基因干扰GSDME能够降低LDH、IL-18和IL-1β释放，证明Dox能够通过Caspase-3/GSDME途径诱导H9c2细胞焦亡。

综上所述，Dox可通过Caspase-3/GSDME途径诱导H9c2细胞焦亡，为Dox用于临床治疗肿瘤患者所引起的心脏毒性提供新的分子作用机制。后续研究中我们将通过在体动物实验进一步明确Dox诱导心肌细胞焦亡的作用机制。