陆嘉逢 杨祖 冒燕 薛永峰 孔令印 王挺 梁波

近年来，利用母体外周血中的胎儿游离DNA进行高通量测序的无创产前检测技术（noninvasive prenatal testing，NIPT）逐渐兴起。利用母体外周血游离胎儿DNA片段进行产前诊断的前提是胎儿游离DNA 含量必须大于母体血浆总游离DNA 的4%，而胎儿游离DNA含量受孕周、母体体重和胎儿顶臀长度的影响［1-2］。同时，由于样本中包括大量母体DNA 及胎儿基因组信息不完整，检测结果会有一定的假阳性或者假阴性，因此该技术的临床定位是进行胎儿染色体非整倍体筛查，对于阳性结果需要借助羊膜穿刺（amniocentesis）或绒毛活检（chorionic villus sampling，CVS）进行确诊［3］。

19 世纪70 年代，Shettles LB［4］和Rhine SA［5］等先后从宫颈分泌物中检测到男性胎儿的Y 染色体，随着荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridiza⁃tion，FISH）技术和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术的广泛应用，证实了母体宫颈分泌物中确实含有胎儿的遗传物质。随着免疫荧光、二代测序和单细胞测序技术的发展及Bol⁃nick在2014年报道一种利用免疫磁珠分离法从脱落宫颈细胞中分离出胎儿滋养层细胞的方法，即TRIC，使得利用子宫颈胎儿滋养层细胞进行产前诊断成为可能。与母体外周血游离胎儿DNA 片段相比，利用子宫颈胎儿滋养层细胞进行检测的方法具有简便易行、可获得细胞数量多、形态学识别容易等优点，具备开发为早期无创产前诊断技术的潜质。当样本中胎儿滋养层细胞比例达到90%以上时，DNA 质量可以与羊膜穿刺或CVS 获得的DNA相媲美。本研究将TRIC 方法与全基因组测序方法结合，进行胎儿染色体异常的分析，为子宫颈胎儿滋养层细胞用于产前诊断提供参考。

材料和方法

一、研究对象

样本来源：选择2018 年1 月到2018 年5 月就诊于苏州市立医院，自然受孕、要求终止妊娠的孕妇，孕5～20 周。本研究得到苏州市立医院伦理委员会批准（审批文号：K-2018-019-H01），并与受试者签署临床研究知情同意书。

样本选取标准：（1）妇科检查及B 超证实为早孕，孕周在5～20 周；（2）取样前未同房。按照以上标准，共选取10例孕妇，年龄20 ～40岁。

二、实验方法和步骤

1.样本采集和处理

利用宫颈刷获取宫颈管脱落细胞，然后将标本置于20 mL PreservCyt（Holigic）溶液中。将含有20 mL PreservCyt 溶 液 的 标 本，4 ℃400×g 离 心5 min，弃上清。加入10 mL 磷酸盐缓冲液（phos⁃phate buffered saline，PBS），4 ℃400×g 离心5 min，弃上清；重复清洗3 次；加入10 mL PBS 重悬细胞，4 ℃保存备用。

2.子宫颈胎儿滋养层细胞荧光检测

10例样本稀释成200 μL PBS中含有50 ～100个细胞，手工涂片。在涂片区域，加入10 μg/mL β-HCG 一抗，4℃孵育过夜。次日洗片，加入异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的二抗孵育1 h。洗片后加入4，6-联脒-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）及防荧光淬灭封片剂，避光保存。荧光显微镜观察样本中是否存在阳性细胞。

3.子宫颈胎儿滋养层细胞的分离及鉴定

选取含有阳性细胞的样本进行阳性细胞分选，分选方法如下：在20 μL 含有250 nm 羊抗小鼠IgG磁性纳米颗粒的混合液中补充无菌PBS 至100 μL，然后加入5 μg 小鼠人类白细胞抗原-G （human leucocyte antigen-G，HLA-G）抗体，混匀，4 ℃孵育过夜。使用DynaMa-旋转磁力架，PBS 清洗磁珠颗粒三次。用1.5 mL PBS 悬起子宫颈细胞，加入抗HLA-G 偶联磁珠，4℃混合孵育过夜。用磁力架结合HLA-G 阳性细胞，收集未结合的细胞，并用PBS 清洗3 次。分别回收HLA-G 结合阳性细胞（胎儿滋养层细胞）和阴性细胞（母体细胞）。将阴性细胞和阳性细胞分别进行稀释，稀释后进行免疫荧光检测，检测方法同上述子宫颈胎儿滋养层细胞荧光检测。

4.荧光原位杂交（fluorescence in situ hybrid⁃ization，FISH）检测

将HLA-G 阳性细胞涂片进行FISH 检测。选用美国Vysis 公司的染色体技术探针（chromosome enumeration probe，CEP）。其 中CEP X 用 绿 色 标记，CEP Y用橙色标记。

5.全基因组扩增

由于磁珠分选后的细胞数量较少，无法通过提取gDNA 进行高通量测序，因此先进行细胞全基因组扩增。使用PicoPLEXTMWGA Kit（美国Rubicon Genomic）对分选后的细胞进行全基因组扩增：将分选后的细胞中加入细胞裂解液进行裂解，随后加入预扩增反应液进行预扩增，最后加入指数扩增反应液进行指数扩增。

6.全基因组低覆盖度测序分析

取全基因组扩增产物，按照NEB Next dsDNA Fragmentase（NEB 公司产品）试剂盒说明书进行片段化，配制反应体系：2 μL Reaction buffer，2 μL dsDNA Fragmentase，300 ng 全基因组扩增产物，无核酸酶水补充至20 μL。37 ℃孵育25 min。片段化后的产物按照Ion Plus Fragment Library Kit（Thermo Fisher）说明书进行高通量测序的文库构建。构建好的文库进行上机测序模板制备，参照Ion Pi Hi-Q Template OT2 200 Kit（Thermo Fisher）说明书，测序过程按照Ion Pi Hiq Seq 200 Kit（Thermo Fisher）说明书进行。

7.测序数据分析

数据经过质控之后，使用TMAP （Torrent Mapper 4.6）软件把测序得到的每个DNA 片段的碱基序列定位到人类基因组参考序列（NCBI Build37/hg19）上，使用Picard 筛去重复序列，选择质量值≥10 且长度≥35 bp 的序列用于下游分析。把每条染色体划分成200 kb 片段大小的非重叠区域，进而计算样本中每个200 kb 窗口上序列分布比例，过滤掉没有信号或者reads 中带“N”的窗口。最终利用环状二元分割算法把每个200 kb 窗口的序列分布比例与参考数据库中正常样本进行比较分析，得出检测样本相对于正常样本某一条染色体区段的比值即CNV 值；若CNV 值大于0.37，则该染色体区段可判断为三体或重复；若比值＜0.51，则该区段可判断为单体或缺失。

结 果

一、胎儿滋养层细胞分离与鉴定

10 例样本经免疫荧光检测共发现3 例样本中存在表达β-HCG 信号的细胞，如图1 所示，左侧为DAPI 蓝色标记细胞核信号，中间为FITC 标记β-HCG信号，右侧为DAPI和β-HCG组合信号。

以上3例样本采用HLA-G 偶联磁珠对宫颈管脱落细胞进行磁珠分选，对HLA-G 阳性细胞和阴性细胞分别进行免疫荧光检测β-HCG 表达情况。图2左侧为DAPI 蓝色标记细胞核信号，中间为FITC 标记β-HCG 信 号，右 侧 为DAPI 和β-HCG 组 合 信号。结果显示，HLA-G 阳性细胞中表达β-HCG 的细胞比例增多（图2，A-C），而HLA-G 阴性细胞中未检测出β-HCG 的表达（图2，D-F），表明磁珠分选的阳性细胞中含有胎儿滋养层细胞，但磁珠捕获的特异性较低。

二、HLA-G阳性细胞FISH检测

对HLA-G 阳性细胞进行FISH 检测，分别检测X 染色体和Y 染色体。表1 为受试者信息，共检测3 个样本，其中1 例样本检测结果显示为男性胎儿（如图3），另外2 例样本检测结果显示为女性胎儿，选取男性胎儿的阳性细胞进行全基因组低覆盖度测序。

表1 受试者信息

三、阳性细胞低覆盖度全基因组测序分析

男性胎儿的子宫颈胎儿滋养层细胞采用低覆盖度全基因组测序分析，该检测流程可以检测出＞4 Mb 的染色体片段缺失和重复，检测结果见图4，未检测到染色体异常。分析结果显示性染色体存在嵌合现象，Y 染色体的嵌合比例为20%。这说明磁珠分选后的阳性细胞中还是混杂了大量的母体细胞，胎儿细胞的比例约为20%，磁珠分选的特异性有待进一步提高。

讨 论

子宫颈胎儿滋养层细胞的来源是由于胎盘的快速扩展，滋养层细胞从胎盘边缘的基底层侵入子宫腺体及血管，随着腺分泌物一起进入子宫腔，随后进入子宫颈。随着胎盘的不断扩张，不断的有胎儿滋养层细胞进入宫颈管，在胎盘扩张停止后（约20周），子宫颈内的胎儿滋养层细胞迅速消失［6］。目前获取子宫颈胎儿滋养层细胞的方法有四种：宫腔灌洗法、宫颈管灌洗法、细胞刷取样法、宫颈黏液抽吸法。Gerit Moser等通过观察1 000例经宫颈刷取样患者妊娠结局，发现取样与否与流产、大出血、和宫腔感染没有相关性［6］。宫腔灌洗法虽然可以得到80%～90%的阳性细胞，但是造成的创伤也较大，对胎儿存在潜在伤害，其安全性有待进一步研究［7］。本研究选用了安全性最高的宫颈刷取样法，但是结果表明宫颈刷取样法获得胎儿细胞成功率较低，10 例样本中仅3 例样本中观察到β-HCG 阳性细胞，后续研究中可尝试套管拭子或者双取器宫颈毛刷法取样［8-9］，提高取样的成功率。

HLA-G 是胎儿滋养层细胞分化并侵入子宫腺体及血管的标记，也是区分胎儿滋养层细胞与母体细胞的标记。研究发现HLA-G 阳性细胞中有94%以上呈β-HCG 阳性，HLA-G 阴性细胞也呈β-HCG阴性，最终得到胎儿基因组含量大于95%的DNA［10］。本研究得到的阳性细胞中胎儿基因组含量约为20%，低于文献报道，需要进一步研究提高免疫磁珠分离胎儿滋养层细胞的特异性。

子宫颈胎儿滋养层细胞最初与FISH 和PCR 技术结合，用于胎儿性别诊断，正确率从24%到95%不等［11］。随着STR 分型检测技术的发展，实现了在孕早期进行准确的性别诊断和染色体异常的检测［12］，也可以预测异位妊娠和空孕囊［13］。有研究者将显微切割法和单细胞测序结合，分离出单一的胎儿滋养层细胞用于单基因遗传疾病的检测［14］。Jain等利用分离出的胎儿滋养层细胞，对全基因组59个STR 位点和94个已知的单基因遗传疾病位点进行深度测序，对胎儿基因位点进行单体型分析［15］。本研究在前人研究基础上，利用全基因组低覆盖度测序检测男性胎儿样本中的染色体异常，证明利用免疫磁珠法分离出的胎儿滋养层细胞可以与已建立的高通量测序方法相兼容，实现产前胎儿全部染色体拷贝数变异的检测。

利用脱落的子宫颈胎儿滋养层细胞进行产前诊断具有无创和早期诊断的优势，发现异常胎儿可及时终止妊娠，减轻孕妇心理创伤，且不受妊娠结局、胎盘病变（如子痫前期）、母体体重指数、产次及母体年龄的影响［16］，可以为临床提供可靠的胎儿基因组样品来源。本研究采用的细胞分离方法操作简单，分离出的胎儿细胞可以在怀孕初期（5 ～20周）进行快速精准的染色体异常检测。本研究一个潜在的局限性是样本量较少，无法说明检测的特异性和灵敏度。另外利用脱落的子宫颈胎儿滋养层细胞进行染色体异常检测还受到以下因素的制约：首先，目前没有分离和鉴定目标细胞的统一标准，不同实验室得到的阳性细胞率不等；其次，目前的研究尚无大规模随机对照、产前妊娠及活产的随访记录，其临床准确性和安全性还有待评估；最后，目前只能对单胎妊娠进行诊断，多胎妊娠及嵌合体妊娠诊断方案还需进一步实验评估。

综上所述，虽然基于子宫颈胎儿滋养层细胞进行无创产前检测还存在很多问题。相信随着细胞分离方法的不断优化以及测序技术的快速发展，子宫颈胎儿滋养层细胞有望发展成一种安全可靠的产前诊断技术，在孕早期对全基因组染色体异常、单基因遗传疾病进行诊断。