姜 曌，徐 典，李 力△

1．空军军医大学西京医院神经内科(西安710032)；2．空军军医大学口腔医院综合科(西安710032)

视神经脊髓炎谱系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD)是一种中枢神经系统的自身免疫性疾病，该病病情凶险且容易复发，给患者的神经系统造成严重的功能损伤。在NMOSD的治疗中，维护阶段的治疗尤为重要。有综述指出，维护期B细胞数量超过总淋巴细胞计数的0.1%时NMOSD易复发，推荐以CD20+B细胞、CD19+/CD27+B细胞的数量来判断NMOSD复发的可能性[1]。目前在临床中使用利妥昔单抗(Rituximab，RTX)来治疗NMOSD效果较好。虽然该药物是CD20+淋巴细胞的抑制剂，但是在临床发现使用该药物的患者单核细胞比例、CD19+B细胞和CD19+/CD27+B细胞的数量均会下降，而这些数据被认为是NMOSD发作或复发的指标。目前在中国患者人群中，上述免疫细胞的比值对于NMOSD发作的阈值鲜有报道。本研究旨在回顾NMOSD患者发病时上述免疫细胞的监测数据及其随着利妥昔单抗治疗后的变化，以期确定适合中国人群的NMOSD复发指标和治疗方案。

对象与方法

1 研究对象 本研究属于回顾性队列研究，通过西京医院电子病例系统查阅、过滤并收集NMOSD复发患者的基本信息、影像学资料、实验室检查数据、用药方案、治疗效果等临床资料。本研究已通过西京医院伦理委员会讨论并获准进行。最终共收集到2016年1月至2018年4月在空军军医大学西京医院神经内科住院治疗的NMOSD复发患者18例，其中男性3例，女性15例；年龄16～64岁，复发时发病时间≤1周，平均年龄(38.9±14.8)岁。病例纳入标准：①年龄15～70岁；②临床表现符合2015版NMOSD诊断共识[2]；③患者及其家属在充分了解病情、治疗方案及可能出现的医疗结局的前提下，同意参与研究与并签署知情同意书；④患者基本资料、各项检查结果及治疗效果等临床资料完整。排除标准：①患有其他自身免疫疾病；②入院前3个月内已经接受糖皮质激素、免疫球蛋白或免疫抑制剂治疗；③患有重症肌无力、癫痫、脑血管疾病、颅内感染性疾病、神经系统肿瘤等。

2 研究方法

2.1 实验室检查：入院后清晨采集空腹静脉血，检测分析单核细胞比例、CD19+B细胞比例、CD19+/CD27+B细胞比值。完成腰穿检查，采用间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence，IIF)试剂盒(德国欧蒙公司)，主要检查血清及脑脊液水通道蛋白-4抗体(AQP4-IgG)、脑脊液白蛋白/血清白蛋白(Cerebrospinal/serum albuminratio,QALB)、24 h鞘内IgG合成率等生化指标。

2.2 神经影像学检查：入院期间接受头颅、颈椎、腰椎MRI及其增强检查，完善视觉诱发电位(Visual evoked potential,VEP)和脑干听觉诱发电位(Brain stem auditory evoked potential,BAEP)检查。

2.3 治疗方案：对症支持治疗的同时积极进行免疫治疗，具体方案为：甲强龙1 g/d，连续5 d；静脉注射免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin，IVIG)0.4 g/(kg·d),连续5 d；二线免疫治疗方案为：利妥昔单抗(Rituximab，RTX)，剂量为每周375 mg/m2，持续进行4周。

结 果

1 各项免疫细胞检查及分析结果 患者入院时进行单核细胞比例、CD19+B细胞比例和CD19+/CD27+B细胞比例检查，见表1。因CD19+B细胞比例和CD19+/CD27+B细胞比例差异较大，故采取负对数转换后进行95%可信区间的单尾分析。根据目前样本量分析，患者复发时CD19+B细胞比例的95%可信区间下限值为0.0060，CD19+/CD27+B细胞比例的95%可信区间下限值为0.0115。见表2。

2 实验室检查结果 18例患者中AQP4-IgG阳性患者14例，阴性患者4例，与性别相关(P=0.043)，与年龄分布未发现统计学关联(P=0.307)。72.2% (13/18)的患者脑脊液白细胞均升高(>5×106/L)，其中11.1% ( 2/18) 患者脑脊液白细胞大于50×106/L。脑脊液蛋白平均56.2 mg/dl(3.2～243 mg /dl)。 9例患者( 9/18，50% ) 24 h鞘内 IgG合成率升高。在AQP4-IgG阳性患者中，颅内MRI检查异常占78.6%(11/14)，脊髓MRI检查异常者占71.4%(10/14)，两者同时存在特征性病变者占到50.0%(7/14)；AQP4-IgG阴性患者4例，其中MRI检查颅内特征性改变者占50.0%(2/4)，脊髓MRI检查异常占75.0%(3/4)，两者同时存在特征性病变者占25.0%(1/4)，典型影像学表现见图1。VEP异常的患者占83.3%(15/18)，其中AQP4-IgG阳性患者为92.9%(13/14)，阴性患者为50.0%(2/4)；BAEP异常患者较少，仅为16.7%(3/18)；VEP与BAEP均异常患者仅有1例。见表3。

表1 入组患者入院时各项免疫细胞检查结果

表2 患者免疫细胞数据分析

注：*CD19+B细胞比例、CD19+/CD27+B细胞比例原始数据做负对数转换后统计，为单尾95%可信区间下限值

表3 18例NMOSD复发患者临床特点比较

注：ON：视神经炎

3 治疗结果 全部18例患者在对症治疗和免疫治疗的基础上，均接受RTX治疗，剂量为每周375 mg/m2，持续4周。治疗结束时，有15例患者临床症状明显改善(15/18，83.3%)，3例患者(3/18，16.7%)临床症状得到缓解。

4 随访时接受外周血免疫细胞细胞监测结果 本研究18例患者中，有5例患者出院后接受了随访和复查，并在随访时接受外周血CD19+/CD27+B细胞检测。具体如图2所示，可见接受利妥昔单抗治疗后的15 d内，患者外周血CD19+/CD27+B细胞比例显著降低，治疗结束时(距复发时1个月)，除1例外，其余患者CD19+/CD27+B细胞比例均降低至0.005以下；随访3个月时5例患者外周血CD19+/CD27+B细胞水平均无升高。

双侧大脑半球对称，灰白质对比自然，脑桥背侧见小片状稍长T2信号影，FLAIR序列呈稍高信号，DWI序列呈稍高信号(A、B、D、E、F中白色箭头)；第4、5颈椎脊髓可见信号改变(C中白色箭头)

图1 典型患者影像学表现

图2 随访5例患者外周血内CD19+/CD27+B细胞比例变化

讨 论

视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica，NMO)是一种免疫介导的中枢神经系统(Central nervous system，CNS)炎性脱髓鞘疾病[3-4]。NMO临床表现为严重的视神经炎(Optic neuritis,ON)和纵向延伸的长节段横贯性脊髓炎(Longitudinally extensive transverse myelitis，LETM)，以青壮年女性多发，具有很高复发率及致残率[5]。其病因主要与水通道蛋白4(Water channel aquaporin-4，AQP-4)抗体(AQP4-IgG)相关[6-7]。随着临床研究的深入，NMO的临床特征不单单局限于视神经和脊髓表现，而是与室管膜周围AQP-4高表达区域密切相关，呈现一系列中枢神经系统脱髓鞘病变疾病谱。国际NMO诊断小组将NMO相关的一系列症候群命名为视神经脊髓炎谱系疾病(NMOSD)并制定了相应的诊断细则[2]。本病尚无特效药物，是神经病学领域的研究重点疾病之一。

本研究采用IIF试剂盒(德国欧蒙公司)，对患者脑脊液进行基于细胞底物(Cell based assay，CBA)和基于组织底物(Tissue based assay,TBA)联合检测，具有较高的敏感度和特异度，因而广泛用于脑脊液中相关生化指标和抗体的检测[8]。发现72.2% (13/18)的患者脑脊液白细胞升高(>5×106/L)，与Bergamaschi等[9]报道79%的脑脊液白细胞升高率接近，但目前的诊疗指南认为该项指标的变化不具备特异性，仅作为临床参考。本研究77.8%(14/18)的NMOSD患者AQP4-IgG阳性，与Waters等人的研究一致[10]。AQP4-IgG阴性的患者通常被认为预后相对较好[11]。统计分析显示，患者性别分布和VEP阳性检出率均与AQP4-IgG阳性率呈正相关(P<0.05)，其他临床特征与AQP4-IgG阳性率未发现有统计学联系见表3，可能是因为本研究中AQP4-IgG阴性的患者数量太少，不足以说明患者临床特征的分布规律。

NMOSD患者的典型MRI表现为病变节段可大于1/2视神经长度及视交叉。急性期时视神经增粗、强化，视神经鞘亦可见强化。慢性期可见视神经萎缩，呈现“双轨征”。脊髓病变典型表现为较长的、纵向延伸的长节段横贯性损害(超过三个椎体节段)，矢状位多表现连续病变，多累及脊髓后索中央灰质和部分白质。急性期出现明显肿胀，呈长T1长T2表现；慢性期脊髓呈现萎缩、空洞，长节段病变可转变为不连续的长T2信号[12]。张植等[13]研究发现，AQP4-IgG(+)患者中43.9%(43/98)存在颅内病灶，且脊髓病变多位于颈段，与Havla等[14]的研究类似。本研究中颅内(11/14，78.6%)及脊髓(10/14，71.4%)MRI检查异常表现与我国NMOSD临床诊疗指南中相关描述基本符合，但是MRI异常的发生率均高于上述国内外学者的研究，可能是由于本研究的对象均为NMOSD复发患者，再次发病时神经系统的影像学病变表现更为突出。

VEP可以检查从视网膜到枕叶皮质的视觉神经通路的功能，其中P100的潜伏期延长反映了视神经轴突存在脱髓鞘病变，说明视神经的传导速度变慢[15]，而波幅的改变反映病变的视神经传导完全阻滞[16]。VEP的P100潜伏期幅度较小被认为是NMOSD的典型表现[17]。本研究中纳入病例均为NMOSD复发病例，故MRI检查发现视神经异常者，其VEP也均有不同程度的异常变化，并且VEP的异常与AQP4-IgG呈统计学关联(P=0.043)，即AQP4-IgG阳性患者中VEP异常的比例更高。BAEP可以反映听觉传导通路是否完整及评价患者的听力状况。Ohnari等研究发现虽然部分NMOSD患者的BAEP正常，但是VEP存在明显异常，提示VEP与BAEP联合检查有助于NMOSD的诊断[18]。本研究中，BAEP的异常与AQP4-IgG不具有统计学关联(P=0.612)，BAEP异常的患者仅有3例(3/18,16.7%)，但是其中有一例患者AQP4-IgG阴性，MRI仅发现颈段脊髓连续病变；但VEP与BAEP同时出现异常，可能是受到MRI分辨率的限制，无法发现颅内异常，而VEP和BAEP检查则可能同时发现异常，说明VEP联合BAEP检查对NMOSD的临床诊断具有鉴别意义。

免疫细胞的表达水平对神经系统疾病，特别是对中枢神经系统自身免疫性疾病的严重程度和预后均有显著影响[19-20]。所以针对B细胞介导的免疫过程，新型靶向免疫抑制药物越来越多地被用来治疗和预防NMOSD复发。RTX是针对B淋巴细胞特异性表面抗原CD20研制的人鼠嵌合的IgG1单克隆抗体，于2005年首次应用于预防NMO复发并取得良好的临床效果[21]。但是RTX用于预防NMOSD复发的具体使用方法和用药指征目前尚无定论[22]，主要有如下几种方案：

第一种：每6～9个月用药一次，剂量同初始治疗[23]。此方案没有检查指标作为用药依据，缺乏循证医学证据支持，仅凭医生经验或患者的症状确定预防用药时机，主观性过大。

第二种：以外周血CD19+B细胞数量为参考。若CD19+B细胞比例≥0.01时，重复输注RTX 100 mg/周，连续输注3周[24]；或者发病时给予每周100 mg/m2，连用3周，后每2个月复查外周血CD19+B细胞数量，如超过0.01时，再给予100 mg/m2一次[25]。在本研究中，根据18例患者复发入院时CD19+B细胞比例最低值为0.001，经过统计学分析，复发时CD19+B细胞比例的95%可信区间最低为0.0105，与上述学者的研究结果相似，说明我国人群NMOSD患者的CD19+B细胞比例如果高于0.0105，其复发可能性大于95%。

第三种：以外周血CD19+/CD27+记忆性B细胞数量为用药依据。按 375 mg/m2(体表面积)，静脉滴注，每周1次，连用4周[26]。Kim SH等人对30例NMOSD复发患者进行了随访观察：前2年，当外周血CD19+/CD27+记忆性B细胞比例超过0.0005时，给予RTX治疗，剂量为375 mg/m2；在此之后，如外周血中CD19+/CD27+记忆性B细胞比例超过0.001则需要再给予RTX，剂量同前[27]。

本研究采用利妥昔单抗每周375 mg/m2，持续4周的治疗方案。这也是目前被临床采用较多的治疗方案。治疗结束时，有15例患者临床症状明显改善(15/18，83.3%)，3例患者(3/18，16.7%)临床症状得到缓解。有5例患者接受了随访并进行了外周血CD19+/CD27+B细胞监测。利妥昔单抗治疗后的15 d内，患者外周血CD19+/CD27+B细胞比例显著降低，治疗结束时(距复发时1个月)，除1例外，其余患者CD19+/CD27+B细胞比例均降低至0.005以下，随访3个月后，5名患者的CD19+/CD27+B细胞比例均无升高。虽然本研究采用的RTX治疗方案取得相对良好的治疗效果，但是随访的患者数量较小，论证级别有限，所以目前利妥昔单抗治疗 NMOSD 的治疗剂量以及防止复发的治疗时机均尚需进一步研究证实[22]。

自身反应性记忆性B细胞激活后产生抗原特异性反应，这种记忆效应可能持续很长时间，从而诱导NMOSD复发[28]。因此很多临床研究关注于删除记忆性B细胞。Kim SH等[29]研究发现，NMOSD复发多发生于CD19+/CD27+记忆性B细胞回升之后。随访5年后，绝对危险度降低率(Absolute risk reduction,ARR)由治疗前的2.4±1.5下降为治疗后的0.3±1.0；18例患者(60%)在5年的随访期内没有复发；28例患者的致残程度均无加重，且没有观察到严重的副作用出现。所以Kim SH等认为，在RTX治疗中CD19+/CD27+记忆性B细胞比例可以作为NMOSD复发的参考指标。经过外周血B细胞删除治疗后，如CD19+/CD27+记忆性B细胞比例超过0.001，应及时给予RTX治疗，以避免复发。本研究也以CD19+/CD27+记忆性B细胞比例作为判断RTX是否需要重新输注临床依据，NMOSD患者复发时CD19+/CD27+B细胞比例的最低值为0.013，其95%可信区间的下限值为0.0115，与Kim SH等建议的0.001(即0.1%)差距较大。可能是因为本研究属于回顾性研究，入组时患者已经出现NMOSD复发症状，此时CD19+/CD27+B细胞比例已经上升并超过了Kim SH等建议的0.001警戒值，加之样本量较小，所以出现了近10倍的差异，但是这也充分说明CD19+/CD27+B细胞比例作为免疫系统表达增强的指标，对NMOSD复发的预警具有十分重要意义。

NMOSD患者外周血中相关淋巴细胞比例是疾病复发的重要参考指标，当外周血中CD19+/CD27+B细胞比例超过0.0115，或CD19+B细胞比例超过0.006，应采取免疫靶向药物对相应淋巴细胞进行清除治疗。以上指标可以作为临床医师治疗NMOSD和预防复发的参考，使临床医师在制定治疗方案时兼顾NMOSD复发的预防和患者经济负担的减轻。而目前针对RTX用于预防NMOSD复发的使用指征目前尚无明确共识，其检测指标和启动预防性用药的阈值均有待于完善设计的临床对照试验加以论证。