张 晨，刘斯汝，王宣敬，蔡 勇，罗 慧，何雨珊，王翻兄，罗文学，扎西英派，阿依木古丽

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，兰州 730030；2.西北民族大学 实验教学中心，兰州 730030；3.天祝藏族自治县畜牧技术推广站，甘肃武威 733200)

高原地区由于明显的低氧环境[1]，许多动物难以生存。藏羊有很强的高原低氧适应能力，是中国西部高原地区特有的绵羊品种，也是青藏高原地区重要的经济畜种[2]。Heat等[3]研究发现，动物进入高原地区后，由于低压低氧的刺激，反射性地引起肺动脉高压，持续高原低氧刺激则可导致高原性心脏病或高地病(Brisket disease)。俞红贤[4]研究也发现高原适应很大程度上取决于动物肺脏的适应性结构基础。有学者报道[5]，急进高原地区人群的Tei(Tei index心肌做功)指数显著增高，LVEF(左室射血分数)和LVFS(左室收缩末内径)则显著降低，表明高原低氧环境也影响心脏搏动能力。在正常心动周期中，窦房结(Sinoatrial node，SAN)为心脏搏动提供窦性心律，当窦房结功能失效时(如斯氏第一结扎)则由房室结(Atrioentricul node，AVN)提供起搏点[6]，房室束(Hisbundle，HB)为心脏搏动信号传导的干束，浦肯野纤维(Purkinje)为信号传导支束，4个结构共同构成心脏传导系统(Cardiac conduction system，CCS)[7]。目前心脏传导系在绵羊[8]、犬[9]、兔[10]、人[11]、骆驼[12]、牛[13]和牦牛[14]等均有研究。藏羊是高原牧区主要的经济动物，目前有关藏羊心脏传导系的结构特点未见相关报道。因此，本文拟研究藏羊心脏传导系的结构特征，为藏羊高原适应的解剖学特性提供基础理论，为低氧低压时心脏传导系的适应机制研究提供重要的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与采样

1岁左右健康藏羊10只，来自青海主月畜牧业屠宰场。羊只断颈放血致死，检查胸腹腔可视病理变化，分离完整心脏，排出心腔积血，生理盐水冲洗，置于4%多聚甲醛(pH 7.4)中固定24 h，采用Davies检查法[15]采集窦房结、房室结、房室束和浦肯野纤维，置换固定液复固定，备用。

1.2 染色

1.2.1 石蜡切片制作 组织固定72 h后，进行常规石蜡切片，连续切片，厚度5 μm。

1.2.2 Delafield氏苏木精—伊红(HE)染色 按照常规HE染色法进行。

1.2.3 PTAH磷钨酸苏木素法 切片脱蜡复水后，氧化液中孵育5 min，漂白液中漂白5 min，5%硫酸铁铵孵育5 min，磷钨酸苏木素 56 ℃染色1 h，95%酒精分化后脱水透明，中性树胶封片。心肌横纹闰盘和心神经呈黑色。

1.2.4 Masson三色染色法 切片脱蜡复水后，Regand苏木精孵育15 min，Masson 丽春红复红液孵育10 min，1%磷钼酸分化，苯胺蓝染色 5 min，0.2%冰醋酸浸洗，95%酒精分化后脱水透明，中性树胶封片。心肌纤维和神经胶质呈红色，胶原纤维呈蓝色，弹性纤维呈浅红色，细胞核呈黑色。

1.2.5 复方碘涂抹法 5%复方碘液与左右心内膜反复涂抹，数秒后Purkinje纤维可呈黑色，黑色仅维持5 min左右，反复显色4次。

1.3 测量与计算

游标卡尺测量每只羊窦房结长度、宽度和厚度，数据用“平均数±标准差”表示。其余数据采用Image Proplus 6.0软件进行测量。每个组织随机取5张切片，每张切片400倍视野随机取10个不同区域，用Image Proplus 6.0观察并测量。HE染色切片中测量窦房结与房室结的长度、宽度和厚度，测量房室束与Purkiinje的纤维直径；测得数据用“平均数±标准差”表示，并用SPSS 22软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 藏羊CCS解剖结构特点

由图 1 可以看出，藏羊窦房结位于前腔静脉与右心耳交界处，沿心脏冠状切面方向分布，新鲜组织中的形态肉眼可辨，心外膜和心内膜均可见，心内膜表面更清晰，为前端宽，后端窄的乳白色长索状，其大小与心脏的体积相关，其余CCS组织肉眼无法辨认。

a.右心房(心内膜侧) Right atrium(endocardial side); ↑↓.窦房结 Sinoatrial node;RE.右心耳 The right atrium;b.左心室 Left ventricle;HB.房室束 Hisbundle; LHB.左房室束 Left hisbundle;AP.Purkinje前群 Purkinje anterior group; MP.Purkinje中间群 Purkinje intermediate group; PP.Purkinje后群 Purkinje posterior group

图1 藏羊心脏传导系分布图
Fig.1 Anatomical characteristics of Tibetan sheep cardiac conduction system

2.2 组织学结构特征

2.2.1 窦房结组织学结构 藏羊窦房结横切面呈长条状，周边由普通心肌纤维围绕，界限清晰，窦房结组织主要由起搏细胞(P细胞)和过渡细胞(T细胞)组成，着色较普通心肌纤维浅；窦房结中有一条微动脉和一条微静脉贯穿(图2-a)。Masson染色显示，P细胞和T细胞胞质呈红色，较普通心肌纤维更细小，细胞间有大量胶原纤维分布(图2-b)，经PTAH染色后，普通心肌细胞可见明显的横纹，窦房结组织中T细胞可见较为清晰的横纹，P细胞中观察不到横纹(图2-c，图2-d)。

2.2.2 房室结组织学结构 藏羊房室结呈卵圆形，外周围绕有致密的覆盖层，中央有大量着色较浅的P细胞聚集成束，每束由3～5个P细胞组成(图3-a)。P细胞间有大量蓝染的胶原纤维和红染的神经胶质，P细胞位于中央，着色较浅，而其周围的普通心肌细胞着色较深(图3-b)。PTAH染色的房室结组织中T细胞可见横纹，P细胞中观察不到横纹(图3-c)。

a.窦房结横切面(HE × 40) SAN transection(HE×40); b. 窦房结横切面(Masson × 40) SAN transection(Masson × 40); c.窦房结横切面(PTAH×40) SAN transection(PTAH × 40); d.窦房结横切面(PTAH × 400) SAN transection(PTAH×400)

←→.SAN组织与普通心肌组织分界线(左侧为右心房肌,右侧为前腔静脉基部) Dividing between SAN tissue and normal myocardial tissue(right atrial muscle on the left,base of the anterior vena cava on the right); A.SAN微动脉 An arteriole of SAN; ☆.心神经，周边有一薄层鞘膜 Heart nerve,a thin layer of sheath membrane around; HM.正常心肌组织 Normal myocardial tissue; SANM.窦房结组织 Sinus node tissue

图2 藏羊窦房结组织学显微结构
Fig.2 Micro-structure of Tibetan sheep sinoatrial node

a.房室结横切面(HE × 40) AVN transection(HE × 40); b.房室结横切面(Masson × 40) AVN transection(Masson × 40); c.房室结横切面(PTAH×40) AVN transection(PTAH×40); d.房室结横切面(HE×400) AVN transection(HE×400); e.房室结横切面(Masson×400) AVN transection(Masson×400); △.覆盖层 Covering layer; ←.P细胞团块(3～5个P细胞) P cell mass(3-5 P cells); ☆.房室结组织间胶原纤维 AVNcollagen fiber；TC.T细胞 Transitional cell

图3 藏羊房室结显微结构
Fig.3 Micro-structure of atrioventricular node of Tibetan sheep

2.2.3 房室束组织学结构 连续切片显示，His束为室间隔横向的长椭圆状，组织结构较为疏松，P细胞着色浅，其间有大量微动脉以及弹性纤维分布(图4-a)。His束组织PTAH染色呈阴性，表明组织中P细胞较多。His束、LHis束及RHis束间均有一微动脉分布。

2.2.4 浦肯野纤维组织学结构 浦肯野纤维分布于心室内膜下层，一个浦肯野纤维断面常有3～5个浦肯野纤维细胞组成(图5-a)。其细胞核较小呈深蓝色，胞质较大呈浅红色，每个细胞首尾相接构成浦肯野纤维(图5-b)；浦肯野纤维外有胶原纤维包裹，浦肯野细胞内有神经胶质和胶原纤维分布，同时发现，浦肯野纤维不能被PTAH染色，但试验发现，浦肯野纤维细胞间有少量毛刷状结构，类似闰盘的结构将细胞分割开来。

2.3 形态学测量

2.3.1 藏羊窦房结与房室结 藏羊窦房结可通过肉眼观察，其形态为一端较宽而薄，另一端窄而厚的长条索状，经解剖学方法测量，其平均长度(8.82±0.09) mm，平均宽度(2.50±1.24) mm，平均厚度(0.82±0.09) mm(表1)。房室结组织肉眼不可辨，经Davies法定位后，其组织位于室间隔与房间隔的交界处，呈长椭圆状，通过显微测量测得其平均长轴为(2 392.45±231.23) μm，平均短轴(1 634.22±124.65) μm(表1)，由于技术原因，房室结厚度数据无法获得。

a.房室束横切面(HE×200) HB transection(HE×200); b.房室束纵切面(PTAH×40) HB Longitudinal section(PTAH×40);☆.左房室束 ;△.右房室束 RHB

图4 藏羊房室束显微结构
Fig.4 Micro-structure of atrioventricular hisbundle of Tibetan sheep

a.左心室浦肯野纤维后群(HE×100) Left ventricular posterior Purkinje group(HE×100); b.右心室浦肯野纤维中间群(HE×100) Right ventricular middle Purkinje group(HE×100); c.左心室浦肯野纤维前群(Masson×400) Left ventricular anterior Purkinje group(Masson×400); d.左心室浦肯野纤维前群(PTAH×400) Left ventricular anterior Purkinje group(PTAH×400);EP.心内膜 Endocardium; ☆.浦肯野纤维横断面 Purkinje cross-sectional; △.浦肯野纤维纵切面 Purkinje longitudinal section; ↑.浦肯野纤维胶原纤维鞘膜 Purkinje elastic fiber sheath; ↓.浦肯野纤维中细胞界限(毛刷状) Cell boundaries in Purkinje(brush-like)

图5 藏羊浦肯野纤维显微结构
Fig.5 Micro-structure of Tibetan sheep purkinje cell

表1 藏羊SAN与AVN形态学测量结果Table 1 SAN and AVN morphological measurement results of Tibetan sheep

注：“N/A”表示数据结果无法获得。

Note:“N/A” in the table indicates that data results unable to get.

2.3.2 藏羊房室束 藏羊房室束为房室节的延续部分，位于室间隔深部，中央纤维环正下方，其横断面为偏圆的椭圆形，平均直径为(868.21±136.44) μm(表2)，His束结构整体偏向左心方向，自上端向下约1 cm处分为两支，其中左支直径为(372.34±13.60) μm，右支直径为(318.44±11.52) μm，两者间差异显著(P<0.05)。

2.3.3 藏羊浦肯野纤维 藏羊浦肯野纤维由左右支束延续，在左右心室内膜表面分为3 个群体(表3)，各个群体的浦肯野纤维直径中，左心室均较右心室大，且差异具有统计学意义 (P<0.05)。同侧心室中，后群浦肯野纤维直径最大，中群次之，前群最小，且各群之间差异显著 (P<0.05)。

3 讨 论

李凤霞[16]研究发现，绵羊窦房结外观呈现上宽下窄的S形。本研究结果显示，藏羊窦房结为头部较宽，尾部较窄的白色长索状，位于前腔静脉与右心耳交界处。Romero等[17]在研究中发现，山羊窦房结为跨膜型结构，心内膜和心外膜均可辨。藏羊同山羊一样，窦房结心内膜和心外膜均肉眼可辨，内膜侧相对清晰。而Copenhaver等[18]发现人类窦房结组织则只能从心内膜侧辨识。本研究发现，藏羊窦房结长、宽、厚较绵羊大[18]。有学者认为，窦房结大小与心脏体积成正比，如在人类[19]、猪[20]和犬[9]等均有此现象，但也有部分学者[21]表示，窦房结大小与心脏体积并无明显比例关系。而本研究结果显示，藏羊心脏窦房结大小与心脏体积具有一定的相关性，而在绵羊[8]并无此现象。藏羊窦房结内部细胞以T细胞为主，辅以少量的P细胞，整体着色较浅，这与李凤霞等[22]对绵羊窦房结的研究结果一致。另外，藏羊的窦房结中有微动脉和微静脉各一条，但有关猪[20]、绵羊[8]、人[11]、兔[10]、大鼠[23]等的报道结果中都没有提到相同的结构，其具体差异需要进一步研究。

表2 His束、LHis及RHis平均直径Table 2 The average diameter of HB,LHB and RHB μm

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note:Different letters indicate significant difference(P<0.05).The same below.

表3 藏羊左心室右心室浦肯野纤维对比Table 3 Comparison of Purkinje fibers in left ventricle and right ventricle of Tibetan sheep μm

藏羊房室结位于室间隔与房室隔的中央，其结构和位置与人类房室结[24]相似，而牦牛房室结则位于房间隔右侧，三尖瓣上方[14]，兔子[10]与豚鼠[25]的房室结均分布于整个房间隔中。同时，本试验发现藏羊房室结呈卵圆形且长轴较长，这与牦牛[14]和绵羊[8]房室结的形态一致。藏羊房室结组织内有大量胶原纤维分布，其间有较多的P细胞和少量的T细胞，这与绵羊[18]类似，而牦牛[14]与山羊[26]的房室结中T细胞数量多于P细胞。藏羊房室结中P细胞呈团状分布，其外层有一薄层弹性纤维膜包裹。有研究表明这种结构具有绝缘作用[27]，且房室结最外围覆以较厚的覆盖层，是心室搁延的结构基础之一[28]。藏羊房室结组织PTAH染色后光镜下没有观察到横纹或闰盘的结构，表明房室结中正常心肌细胞与T细胞数量较少，其具体结构仍需进一步研究。

His束为房室结组织的延续，位于室间隔深部[29]，肉眼不易辨别。本研究中，连续切片观察发现藏羊His束呈圆柱状，其直径自上而下逐渐缩小，而后分为左侧LHis束与右侧RHis束，其中LHis束直径显著大于RHis束(P<0.05)，这与Duan等[14]在牦牛中发现的结果一致。藏羊His束其内部细胞结构散乱，P细胞数量较T细胞多，His束周围均有一层结缔组织包饶。另外，试验发现藏羊His束中有丰富的毛细血管分布，LHis与RHis中央各有一条微动脉贯穿。

复方碘液涂抹法[30]可在短时间内显示浦肯野纤维，本研究中藏羊浦肯野纤维在左右心腔中均有3个分支群，左侧分支较右侧明显，从心内膜表面即可辨认，这与牦牛[14]浦肯野纤维结构特点相似。其中前群较细，位于前乳头肌附近；中间群由前后支吻合而成，位于室间隔附近；后群较粗，位于后乳头肌附近，3 个群体在远端呈网状吻合。此结果与Ansari等[31]在绵羊浦肯野纤维研究中的结果一致。藏羊浦肯野纤维常由3～5个浦肯野细胞组成，其间有神经胶质和胶原纤维分布。同房室结结构类似，浦肯野纤维外周包裹有一薄层胶原纤维，可能也有绝缘作用。Shimada等[32]发现山羊心脏浦肯野纤维之间出现类似毛刷状结构，为浦肯野细胞间的一种连接方式，其功能与闰盘类似。试验中PTAH染色后，藏羊浦肯野纤维之间也出现类似毛刷状结构，其具体功能有待进一步研究。