王玉丹，杨春雪

(东北林业大学 园林学院，哈尔滨 150040)

盐碱地的土壤中含有大量的可溶性盐类，其物理化学性质差，会抑制植物生长，甚至导致其死亡，影响农林牧业生产和生态环境的可持续发展。近年来，水、土、生物资源被过度开发利用，日渐干旱的气候，致使盐碱化面积不断增加[1]。作为中国重要的后备土地资源[2]，盐渍土的恢复、治理与利用刻不容缓。丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal，AM)真菌既能和80%的植物构成共生体系，也能作为潜在的接种于盐渍土的一种真菌[3]。在AM真菌与植物建成共生体系后，植物给其提供光合产物，AM真菌利用其菌丝网络协助宿主植物汲取水分和养分，两者互利共生，形成遍布干旱、盐碱等各种生境的共生体。AM真菌及其庞大的菌丝网络对于维持盐土区脆弱的生态平衡具有重要意义[4]。

鹅绒委陵菜(Potentillaanserina)为多年生草本植物，蔷薇科委陵菜属，又称蕨麻，是一种典型的匍匐茎型莲座状植物，有较高观赏价值，是退化松嫩盐碱草地恢复初期的主要先锋物种之一[5]，其耐盐碱[6-9]且能与AM真菌共生[10]，但对于其根际AM真菌类型及侵染特性却鲜有报道。在盐碱土里，AM 真菌种群的结构往往较特别，一些拥有特殊用途比如有强耐盐碱性的 AM菌种或许就隐藏其中[11-12]，基于此，本研究拟对松嫩盐碱草地鹅绒委陵菜根际AM真菌的类别进行鉴定，以期开发利用AM真菌资源，获得更多具有较强耐盐碱特性的AM真菌菌种，为更好地推广鹅绒委陵菜-AM真菌共生体在盐碱地修复中的应用，以及在盐碱化城市绿化中的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究样地

研究样地位于松嫩草地西南部黑龙江省肇东市，属温带大陆性半干旱气候[13]，昼夜温差较大。该地处于森林草甸和草原区域[14]，降水集中于 7-9月。土壤类型主要有盐土、碱土和草甸土，盐土以碳酸盐为主，碱土主要为碳酸钠和碳酸氢钠，碱化草甸土盐分的含量较少[15]。

1.2 试验方法

1.2.1 采样方法 于2018-07-05在肇东市松嫩盐碱草地上采集鹅绒委陵菜根系土壤及植株。随机选取鹅绒委陵菜生长茂盛且杂草少的样地，用“五点取样法”采集鹅绒委陵菜根际土壤[16]。去除表层石块及枯枝等杂物，向下挖并收集约10～20 cm深的鹅绒委陵菜根际土壤及根系1.5 kg，最后经“四分法”保留 1 kg，共选取10个采样地，其位置为125°54′0.72″～125°54′15.85″N，46°2′53.88″～46°2′57.12″E(表1)，将10个样地的土样进行编号，记录其经纬度带回实验室，于通风良好的避光处自然风干，用20目筛子筛去杂物，分别装入密封袋于4 ℃密封储存。将鹅绒委陵菜的根清洗干净后剪成1 cm左右根段浸入FAA固定液(福尔马林 5 mL，冰醋酸5 mL，φ=70%酒精 90 mL)中，标记后放入4 ℃冰箱密封存储。

1.2.2 AM真菌定殖率的测定 用碱解离-Trypan blue染色法[17]对根进行染色。从固定液中夹出根段，在清水下冲洗至无刺激性气味后，用φ=10% KOH 90 ℃水浴1 h软化透明，之后用φ=2%的盐酸中和30 min，将根段取出，加入曲苯蓝试剂(Trypan blue)90 ℃水浴30 min进行染色。将染色后的根段制片，在光学显微镜 (OLYMPUS-DSX500)下镜检菌丝、丛枝、泡囊等形态结构，统计丛枝丰度(% )、泡囊丰度 (%)、定殖强度 (%)和定殖率(%)[18]，详细记录菌丝的形态结构并拍照，之后用 MYCOCALC软件对数据进行处理。

1.2.3 AM真菌孢子的分离鉴定 将鹅绒委陵菜根际土壤中的 AM 真菌孢子利用湿筛倾析-蔗糖离心法[16]筛取后，将其置于培养皿中，用超声波清洗仪清洗干净后在双管实体解剖镜下统计孢子个数。体视显微镜下初步观察孢子特征，用移液枪取单个孢子于载玻片上，加乳酸制片，在光学显微镜(OLYMPUS-DSX500)下记录孢子的颜色、纹理，并测量其大小、孢壁厚度等特征。用Melzer’s把孢子染色，记录其显色特异性变化并拍照。最后根据《VA 菌根真菌鉴定手册》[19]及国际丛枝菌根真菌保藏中心(INVAM)官网上提供的形态特征描述、图片，以及近期新发表记录种的文献对AM 真菌种类进行鉴定。

1.2.4 土壤pH测定 称取10 g土样溶于10 mL去离子水中，震荡数分钟，静止30 min，取上层较清澈溶液用于pH测定。

1.2.5 AM真菌孢子多样性指标测定 分离频度(Occurrence frequency,F)：指某种或某属的真菌在样本总体中的出现频率。

F=AMF某种出现的次数/总样本数×100%

相对多度(Relative abundance,RA)：指某一AM真菌种的个体数在群落总物种数中的比率。

RA=某属或种的孢子数/该地区AM真菌孢子总数×100%

重要值(Importance value,IV)：IV=(F+RA)/2×100%

1.3 数据分析

用SPSS 17.0软件对AM真菌多样性指标进行分析，测定数值用“平均值±标准误”表示；采用Word 2019绘制表格。

2 结果与分析

2.1 鹅绒委陵菜根际菌根共生的结构特征

样地中的鹅绒委陵菜根系均被AM真菌侵染，经观察，其形成疆南星型(Arum-type，A-型)丛枝结构(图1)。侵染菌丝由根外侵入鹅绒委陵菜根系内(图1-1)，形成胞间菌丝(图1-2、1-3)和胞内菌丝(图1-4)。根内菌丝一部分二分叉式生长形成花椰菜状的丛枝结构(图1-5)，一部分顶端膨大形成泡囊(图1-6)。鹅绒委陵菜根系内泡囊较多，其形状大多为圆形(图1-6)，也有部分为椭圆形或不规则形(图1-7、1-8)。

2.2 鹅绒委陵菜根际AM真菌定殖状况

试验结果如表1所示：10个样地的土壤类型均为碱性盐渍土，pH为7.60～8.39。各样地中，鹅绒委陵菜根系均被AM真菌侵染，且侵染率均很高，有70%的样地达到100%定殖。在不同pH下，根系的定殖状态不同，当pH为最高(8.39)时，定殖强度和丛枝丰度也为最高，分别为 49.17%和11.41%；而当pH为最低(7.60)，根系定殖率也处于最低值96.30%；在pH为7.70时，泡囊丰度达到最大值21.94%；泡囊丰度和丛枝丰度在pH为8.23时同时达到最低值2.61%和 0.79%，定殖强度在pH为7.72时为最低值20.60%。

2.3 鹅绒委陵菜根际AM真菌的多样性

试验结果表明：松嫩平原盐碱化草地中鹅绒委陵菜根际富含AM真菌资源，共分离出8属38种AM真菌(图2)，其简要描述见表2。其中，球囊霉属(Glomus)和无梗囊霉属(Acaulospora)为鹅绒委陵菜根际AM真菌优势属，其重要值均大于50%，分别为67.45%和55.98%；原囊霉属(Archaeospora)的重要值为44.72%，为最常见属；内养囊霉属(Entrophospora)和盾巨孢囊霉属(Scutellospora)的重要值为27.20%和16.26%，为常见属；近明囊霉属(Claroideoglomus)、根生囊霉属(Rhizophagus)和隔球囊霉属(Septoglomus)为稀有属，其重要值均为5.16%。松嫩盐碱草地鹅绒委陵菜根际优势AM真菌种类为黑球囊霉(G.melanosporum)，其重要值为60.38%，且在10个样地中均分离得到；薄壁原囊霉(Ar.leptoticha)的重要值为44.72%，为最常见种；其他常见种和稀有种的类别较多，详见表3。另外，在所有样地中，1号和4号的AM真菌种类较多，均为12种，占鉴定出的真菌总种类的30.77%； 7号和9号样地鉴定出的AM真菌种类较少，为 7种，占总数的17.95%。

1.根外菌丝H(hypha)侵入鹅绒委陵菜根系 Extracellular hyphae；2.根外菌丝侵入根系后形成胞间菌丝H(hypha)及菌丝顶端膨大形成了椭圆形的泡囊V(vesicle) Intercellular hyphae and elliptical vesicles；3.有隔菌丝H(hypha) Septahypha；4.根内菌丝圈HC(hyphal coil) Hyphal coil；5.根内菌丝H(hypha)及菌丝二叉式生长形成的花椰菜状丛枝A(arbuscule) Hyphae and arbuscular；6.菌丝H(hypha)二叉分支及顶端膨大形成的圆形泡囊V(vesicle) Spherical vesicle；7.有隔菌丝H(hypha)及不规则形的泡囊V(vesicle) Septahypha and irregular vesicle；8.椭圆形及圆形的泡囊V(vesicle) Oval and circular vesicles

图1 鹅绒委陵菜AM真菌菌根显微结构
Fig.1 Microstructures of AM fungi ofPotentillaanserina

表1 采样地位置和AM真菌侵染鹅绒委陵菜根系状况Table 1 Distribution of sampling sites and colonization of AM fungi in the roots of Potentilla anserina

注：A型菌根即为疆南星型菌根。

Note: AM type A is Arum-type.

表2 松嫩盐碱草地鹅绒委陵菜根际AM真菌形态描述Table 2 Morphological description of AM fungi in rhizosphere of Potentilla anserine in Songnen saline-alkaline grassland

(续表2 Continued table 2)

属名Speciesname学名Scientificname颜色Color形状Shape孢子大小/μmSporesize其他特征Others黑球囊霉G.melanospo-rum黑棕色至黑红棕色Blackbrowntoblackreddishbrown球形至近球形,卵形或椭圆形Sphericalorclosetospheri-cal,ovateorel-liptical165～250孢子表面常附着不匀的薄壁菌丝,连孢菌丝很难观察到Thin-walledhyphaeoftenadheredtothesurfaceofthespore,andthehyphaeattachedtothesporeisdifficulttoobserve木薯球囊霉G.manihotis黄色Yellow球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal162～225(～350)在Melzer,s试剂中呈现淡紫色不均匀大斑块,连孢菌丝单根,圆筒形或喇叭形,连点开放稍缢缩IntheMelzer,sreagent,therearelargeplaqueswithunevenlavender,andthehyphaeattachedtothesporeissingle,cylindricalortrumpet-shaped,andthepointsisopenorslightlycon-tracted凹坑球囊霉G.multiforum深黄至棕色Darkyellowtobrown球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal(125～)140(～175)L3孢子壁饰有圆形或卵圆形凹坑ThesporewallofL3decoratedwithroundoro-valpits膨果球囊霉G.pansihalos黄色、黄棕色或黑橘色Yellow,yellowbrownorblackorange球形或近球形,椭球形Sphericalorclosetospheri-cal,elliptical110～190表面有灰白色薄壁菌丝,连孢菌丝单根,直或弯,连点开放或由L3封闭,L1在乳酸中膨胀Thesurfaceofsporeisattachedwithgray-whitehyphae,andthehyphaeattachedtothesporeissingle,straightorcurved,theconnectionpointisopenorclosedbyL3ofsporewall,andL1swellsinlacticacid网状球囊霉G.reticulatum黑红棕色Blackredbrown球形、近球形或不规则形Sphericalorclosetospheri-cal,irregularshape80～150孢子表面有较规则的网状纹饰,网纹四边形或多边形,连孢菌丝直筒或微漏斗形Thesurfaceofthesporehasaregularquadrilat-eralorpolygonalmeshpattern,andthehyphaeattachedtothesporeisstraightorfunnelshaped弯丝球囊霉G.sinuosum黄色至橙褐色或深棕色Yellow,orangebrownordarkbrown倒卵形、椭圆形,厚垣孢子Obovateorellip-tical,chlamydo-spore44(～80)×82(～150)孢子外层孢壁常密被菌丝,形成孢子果,孢子果球形近球形Theoutersporewallofthesporeisoftendense-lycoveredwithhyphae,formingsporocarp,andthesporocarpissphericalandnearlyspherical地表球囊霉G.versiforme黄至黄棕色Yelloworyellowbrown圆或近圆形Sphericalorclosetospheri-cal90～150L3孢子破裂后可见,呈亮金黄色,连孢菌丝成熟后脱落,连点直或小喇叭状L3isvisibleafterthesporerupture,anditisbrightgoldenyellow.Thesporehyphaefalloffaftermaturity,andtheconnectionpointisstraightortrumpet-like沃克球囊霉G.walkeri白色至淡黄色Whiteorpaleyellow球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal(85～)129(～170)在Melzer,s试剂中呈均匀淡红色或不均匀斑块状,连孢菌丝单根,直或弯曲,管状或扩张SporesarereddishorunevenplaqueinMelzer,sreagent,thehyphaeissingle,straightorcurved,tubularordilated无梗囊霉属Acaulospora双网无梗囊霉A.bireticulata淡黄绿色Lilghtyellowgreen球形至椭圆形Sphericaltoel-liptical120～150×140～180孢子表面饰有双层网纹,网孔呈多角形,孢子中含有透明的小油滴Thesurfaceofthesporeisdecoratedwithdoub-le-layerednetting,themeshispolygonal,andthesporecontainstransparentsmalloildroplets椒红无梗囊霉A.capsicula橘红色至辣椒红Orangeorred球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal170～310发芽壁GW2双层,GW2-L1表面有珠状颗粒GerminalwallGW2doublelayer,surfaceofGW2-L1hasbeadparticles空洞无梗囊霉A.cavernata浅黄至黄棕色Lightyelloworyellowbrown球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal80～150有圆形或卵形凹坑纹饰,坑与坑直接由脊分开,孢子内含物为细小均匀的油滴Thereareroundorovalpitpatterns,thepitsaredirectlyseparatedbytheridges,andthesporecontentsarefineanduniformoildroplets丽孢无梗囊霉A.elegans黄棕色Yellowbrown球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal90～140L1层状壁,表面有双层纹饰,纹饰为密集细刺,刺外附有一层蜂窝状隆起的透明网ThesurfaceoftheL1hasadouble-layeredpat-tern,decoratedwithdensefinethorns,andatransparentmeshwithahoneycomb-likebulgeattachedtothethorn

(续表2 Continued table 2)

属名Speciesname学名Scientificname颜色Color形状Shape孢子大小/μmSporesize其他特征Others凹坑无梗囊霉A.excavata浅黄棕色Lightyellowbrown球形或近球形Sphericalorclosetospheri-cal120～165表面有圆至近圆形大凹坑纹饰,有碎屑Thesurfaceofthesporehasaroundtonearlyroundlargedimplepatternwithdebris詹氏无梗囊霉A.gerdeman-nii浅黄色至黄褐色Lightyelloworyellowbrown近球形、卵形或椭圆形Spherical,ovateorelliptical125～200×150～250(～300)孢子外轮廓不整齐,表面不平滑不规则,具有脑纹状旋绕,易碎,破口边缘不整齐Theoutercontourofthesporeisnotneat,thesurfaceisnotsmoothandirregular,andithasabrainstriatepattern.Thesporeisfragile,andtheedgeofthecreviceisnotneat光壁无梗囊霉A.laevis浅黄色至棕色Lightyelloworbrown球形Spherical100～250孢壁均为柔性,L1光滑透明;L2层状淡橙褐色;L3浅黄色Thesporewallisflexible,L1layerissmoothandtransparent;L2layerispaleorangebrown;L3layerislightyellow皱壁无梗囊霉A.rugosa浅黄色Lightyellow球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal90～120破裂后形成皱折呈波浪状不脱落Afterrupture,thesporewalliswrinkledandwavywithoutfallingoff细凹无梗囊霉A.scrobiculata淡黄至黄褐色Lightyellowtoyellowishbrown球形或近球形Sphericalorclosetospheri-cal110～160表面有凹坑形纹饰,凹坑为圆形、长形、多角形或几个相连成不规则的弯曲形Thesurfaceofsporehasapit-shapedpattern,andthepitsareround,elongated,polygonalorseveralconnectedinanirregularcurvedshapeAcaulospora.Sporocapia黑红棕色Blackredbrown球形至椭圆形Sphericaltoel-liptical(160～240)×(125～200)外层壁粗糙内层壁光滑,内层橘粉色或红紫色Theoutersporewallisrough,theinnerwallissmooth,andtheinnerlayerisorangepinkorreddishpurple刺无梗囊霉A.spinosa浅黄色或深棕黄色Lightyellowordarkbrown球形、近球形或不规则形Sphericalorclosetospheri-cal,irregularshape90～300×110～350孢子壁上饰有针状刺突Aneedle-likeprojectionisattachedtothesporewall疣状无梗囊霉A.tuberculata红棕色至深棕色Reddishbrowntodarkbrown球形Spherical150～300L1表面饰有圆形小瘤突,在Melzer,s试剂中呈棕黄色TheL1layerisdecoratedwitharoundedsmallknobandisbrownishyellowintheMelzer,sre-agent原囊霉属Archaeospora薄壁原囊霉Ar.leptoticha灰白色至浅黄色Graytolightyellow球形、近球形、卵圆形或不规则形Sphericalorclosetospheri-cal,irregularshape50～250孢子表面常有一些附着物或呈脱斑状,有些还具有不明显的网状饰物Thesurfaceofsporesoftenhavesomeattach-mentsorarespotted,andsomehaveinconspic-uousmeshornaments内养囊霉属Entrophospora波罗的海内养囊霉E.baltica浅黄至橘色Lightororange球形至近球形Sphericalorclosetospheri-cal200～270外覆菌丝套,由无色透明至浅黄色、互相缠绕、蜿蜒卷曲的菌丝组成,在Melzer,s试剂中呈胭脂红色Thesporesarecoveredwithhyphae,whicharecolorless,transparenttopaleyellow,inter-twined,andcurled,andarecarmineredinMelzer,sreagent近明囊霉属Claroideoglo-mus近明球囊霉Claroideoglo-mus.lamello-sum黄色至暗黄色Yellowtodarkyellow厚垣孢子、球形、近球形Sphericalorclosetospheri-cal,chlamydo-spore95～130连孢菌丝圆柱形,常从孢子上脱落,菌丝壁透明Thehyphaeiscylindrical,oftendetachedfromthespore,andthehyphaewallistransparent根生囊霉属Rhizophagus根内根生囊霉R.intraradi-ces淡黄色至棕黄色Lightyellowtoyellow-brown球形或近球形Sphericalorclosetospheri-cal60～170连孢菌丝一根,孢壁在进入连点时形成火焰状喇叭形。在Melzer,s试剂中呈深红色Thehyphaeattachedtothesporeissingle,thesporewallformsaflamingflarewhenenteringthejunction.ThesporeisdarkredinMelzer,sreagent盾巨孢囊霉属Scutellospora网纹盾巨孢囊霉Scu.reticulata橘红色至黑红棕色Orangetoblackreddishbrown圆形至近圆形Sphericalorclosetospheri-cal380～430L1有突起的四至八边形的网格覆盖,网格上有钝圆锥形的刺L1iscoveredbyaraisedquadrilateraltooctag-onalmeshwithabluntconicalthornonthegrid隔球囊霉属SeptoglomusSeptoglomus.constrictum红棕色至黑棕色Reddishbrowntodarkbrown球形、近球形Sphericalorclosetospheri-cal125～205连孢菌丝连点缢缩,仅留一狭小孔道,连孢菌丝在连点下方膨大并常向一侧弯曲Theconnectionpointissquashed,leavingonlyanarrowchannel,andthehyphaeisswollenbe-lowthejunctionandoftenbendtooneside

(图续转下页 Be continued in next page)

图2 分离的8属38种AM真菌Fig.2 38 AM fungi species in eight genus isolated in this study

表3 松嫩盐碱草地鹅绒委陵菜根际AM真菌多样性及其分布Table 3 Distribution and diversity of AM fungi around the roots of Potentilla anserina in Songnen salt-alkali grassland

3 讨论与结论

本试验通过对松嫩盐渍化土地上鹅绒委陵菜根际AM真菌类型及其菌根侵染特性的探究发现，在pH为7.60～8.39的土壤条件下，鹅绒委陵菜根系均有菌根定殖且具有很高的定殖率并形成疆南星型(Arum-type)菌根结构。之前有研究表明，重楼型(Paris-type)菌根结构类型在野生被子植物中占优势，而本研究结果与此观点不同，可能的原因是不同植物的根皮层细胞壁结构不同，细胞间隙大小有差异，这些对AM真菌菌根结构的形成有影响[20]。有研究表明，土壤pH越高则会抑制AM真菌孢子的产生和菌根的形成[21]，但本试验中并未出现这一现象，在不同的土壤pH条件下，鹅绒委陵菜根部都有菌根定殖且具有很高定殖率，而且研究发现pH较高的样地AM真菌定殖强度高于pH较低的样地，孢子密度没有明显差异。产生这一现象的原因可能是取样地的pH适合本地AM真菌生存，而且其他土壤因子如土壤肥力、土壤微生物等以及宿主的作用也可能会使AM真菌的定殖率与产孢发生变化[22-23]。

本试验共分离鉴定出AM真菌8属38种，包括球囊霉属20种，占比67.45%，是松嫩盐碱草地鹅绒委陵菜根围优势属，无梗囊霉属次之，共12种，占比55.98%，这一结果与前人许多研究结果相似，也验证了球囊霉属和无梗囊霉属为生态适应性较强的两个属[24]。球囊霉属在鹅绒委陵菜根围占绝对优势，其种类多分布广，可能的原因是其产孢率高于其他属，在属间竞争中占优势，并且其本身适应性强，因而成为鹅绒委陵菜以及许多植物的根围优势属，但不同的植物根围优势菌种往往不同。摩西球囊霉(Glomusmosseae)、根内球囊霉(Glomusintraradices)、网状球囊霉(G.reticulatum)等均为不同地区不同植物中常见的优势种[25-27]，而在本试验中，鹅绒委陵菜根围优势菌种为黑球囊霉(G.melanosporum)，这可能是因为AM真菌与宿主间的亲和性以及两者彼此间的选择关系影响优势菌种种类[28]。众所周知AM真菌可以增强宿主对矿质养分的选择性吸收，从而减轻盐碱胁迫对其生长的危害[29]，但是在盐渍土的植被修复中，发挥功能的只能是那些对盐碱胁迫有较强抗性的菌种。本研究鉴定出的AM真菌类别和之前对松嫩平原盐渍土地上的植物根际AM真菌种类的探究成果[10,27,30]有许多相同菌种，比如根内根生囊霉(R.intraradices)、膨果球囊霉(G.pansihalos)、地表球囊霉(G.versiforme)、薄壁原囊霉(Ar.leptoticha)等，可以考虑这些种类的AM真菌是否具有更强的耐盐性，为耐盐菌株的筛选提供思路。

本研究结果表明，松嫩平原盐渍化草地鹅绒委陵菜根际富含AM真菌资源，今后可加强对其真菌资源的开发并推广鹅绒委陵菜-AM 真菌共生体在盐碱地修复中的应用，为AM真菌-植物共生体系在盐碱化城市绿化中的推广奠定基础。