贾艳菊，崔洪艳，刘 颖，王焕荣

ATP结合匣式转运子G2（ATP-binding cassette family G2 transporters，ABCG2）是胎盘中表达最高的主动转运子[1]，由655个氨基酸组成，基因编码区位于染色体4q22，由16个外显子和15个内含子组成，具有多态性[2-3]。最近研究表明ABCG2除可通过有效地形成母胎循环间的屏障，转运毒素、药物或异生物质及改变药代动力学及药效学保护胎儿外，在某些妊娠并发症，如妊娠期糖尿病、妊娠期肝内胆汁淤积症、胎儿生长受限（FGR）和子痫前期的发生、发展及治疗中也有一定的作用[4]。

全球范围内，子痫前期影响2%～8%的妊娠[5]，是孕产妇及围生儿病死率升高的主要原因，其临床表现多样化，至今病因及发病机制尚未完全阐明[6]，滋养细胞浸润过浅，螺旋小动脉重铸障碍是子痫前期发病的中心环节，大量基础研究致力于胎盘滋养细胞在子痫前期发病中的作用。笔者在前期研究中发现子痫前期胎盘组织ABCG2 mRNA高表达[7]，原代培养的子痫前期胎盘滋养细胞在不同分化时期ABCG2 mRNA及蛋白的表达均高于正常[8]，但其表达升高是否对滋养细胞的功能有影响以及相关机制仍属未知。人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）是由胎盘合体滋养细胞分泌的一种糖蛋白激素，通过绒毛间隙进入母血循环，故孕妇血hCG水平可反映胎盘滋养细胞的分化功能。hCG是由α和β亚基结合形成的二聚体，β亚基为hCG所特有，是临床常用的检测血hCG水平的指标。βhCG水平异常可作为胎盘功能不良的早期信号，早在1934年就有学者发现子痫前期患者血hCG水平明显升高。本文基于前期研究结果，进一步应用RNA 干扰 （RNA interference，RNAi） 技术使细胞ABCG2表达沉默后，将β-hCG作为评价滋养细胞分化及功能的指标，分析ABCG2的表达对子痫前期滋养细胞分泌hCG的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象选择2016年6—12月于天津市中心妇产科医院（我院）行剖宫产分娩的正常孕妇及重度子痫前期患者各10例，重度子痫前期诊断符合《妇产科学（第8版）》[9]诊断标准，2组孕妇均为汉族，单胎妊娠，既往无高血压、心脏病、糖尿病及肾病史。2组孕妇终止妊娠时孕周比较，差异无统计学意义[（36.31±1.16）周vs.（35.41±1.09）周，t=1.794，P=0.090]，剖宫产术中留取无菌胎盘样本行原代细胞培养用于后续实验，研究经我院伦理审查委员会批准。

1.2 主要试剂兔抗人ABCG2抗体来自Abcam公司，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）应用 PrimeScriptTM试剂盒，TRIzol、荧光定量PCR试剂盒来自Thermo Fisher Scientific公司，应用仪器为Power SYBR Green PCR Master MIX，系统为ABI Prism 7900。大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞购自北京索莱宝科技有限公司，293T细胞株购自ATCC，pSRL-SIH1-H1-GFP慢病毒载体由上海吉凯基因提供，引物由南京金唯智生物科技有限公司设计合成，质粒提取纯化试剂盒购自Biomega公司，DNA凝胶回收试剂盒购自碧云天公司，脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。β-hCG检测试剂盒购自DRG Instruments公司，RPMI 1640培养基、胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司，胰酶购自Gibco公司，胶原酶、Ficoll购自Sigma公司，兔抗人细胞角蛋白7（CK7）抗体、兔抗人波形蛋白（Vim）抗体、HRP标记羊抗兔IgG二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，培养板和培养皿购自Corning公司，其他试剂（多聚甲醛、PBS、Tween、Triton X-100、氛、氯仿、异丙醇等RNA提取所需试剂）为常规国产试剂。

1.3 设计合成ABCG2小干扰RNA（siRNA）靶序列根据ABCG2 mRNA在GenBank中的序列，结合已有文献报道以及siRNA预测工具Genscript siRNA Target Finder、Ambion siRNA Target Finder的预测结果，设计合成以下3个ABCG2的靶向siRNA序列，与任何编码序列无同源性。ABCG2 siRNA1：正义链GCACAGCAAATGCTGTCCT，反义链AGGACAGCATTTGCTGTGC。ABCG2 siRNA2：正义链GCAGGGACGAACAATCATC，反义链 GATGATTGTTCGTCCCTGC。ABCG2 siRNA3：正义链CATGTACTGGCGAAGAATA，反义链TATTCTTCGCCAGTACATG。

1.4 验证慢病毒表达载体的构建和干扰效果

1.4.1 siRNA前体短发夹RNA（shRNA）表达退火序列的设计 siRNA靶点序列确定后，设计2条siRNA表达元件退火序列。ABCG2 siRNA1-上游：GATCCGCACAGCAAATGCTGTCCTTTCAAGAGAAGGACAGCATTTGCTGTGCTTTTTTG；ABCG2 siRNA1-下游：AATTCAAAAAAGCACAGCAAATGCTGTCCTTCTCTTGAAAGGACAGCATTTGCTGTGCG。ABCG2 siRNA2-上游：GATCCGCAGGGACGAACAATCATCTTCAAGAGAGATGATTGTTCGTCCCTGCTTTTTTG；ABCG2 siRNA2-下游：AATTCAAAAAAGCAGGGACGAACAATCATCTCTCTTGAAGATGATTGTTCGTCCCTGCG。ABCG2 siRNA3-上游：GATCCCATGTACTGGCGAAGAATATTCAAGAGATATTCTTCGCCAGTACATGTTTTTTG；ABCG2 siRNA3-下游：AATTCAAAAAACATGTACTGGCGAAGAATATCTCTTGAATATTCTTCGCCAGTACATGG。

1.4.2 合成的shRNA序列退火形成双链DNA 根据之前设计合成片段信息，合成3对互补的shRNA序列，两端带有BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点黏性末端，退火后得到的双链产物无需酶切可直接连入BamHⅠ和EcoRⅠ线性化的pSRLSIH1-H1-GFP 载体。引物溶解至 100 pmol/μL，各取 3.5 μL，在1×退火缓冲液中煮沸变性3 min，放置室温1 h退火。退火产物上样至3%琼脂糖凝胶电泳。

1.4.3 退火片段与线性化的pSRL-SIH1-H1-GFP载体连接、转化及鉴定 退火产物按照1∶100稀释，取5 μL做连接反应，pSRL-SIH1-H1-GFP载体酶切，酶切产物上样至1%琼脂糖凝胶，电泳至适当位置后，紫外灯下切胶回收。最终洗脱体积40 μL。对回收后的载体定量后，进行DNA连接反应。转化连接产物，提取细菌培养物中的质粒并酶切鉴定。每种ABCG2 siRNA质粒分别挑取2～3个克隆做鉴定，每种质粒分别选择1个克隆送测序，测序结果显示序列无误。

1.4.4 3种pSRL-SIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA表达载体在293T细胞中干扰效果的检测 转染293T细胞（ABCG2在293T细胞中高表达），实验分组：293T细胞组，pSRL-SIH1-H1-GFP-siR-Control组 ，pSRL-SIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA1组，pSRL-SIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA2组和pSRLSIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA3组。提取各组细胞的RNA，采用紫外分光光度法测定RNA在260 nm和280 nm的吸光度，计算RNA含量。实时荧光定量PCR及蛋白质印迹（Western blotting）分别检测pSRL-SIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA表达载体对ABCG2 mRNA及蛋白表达的影响，选择可有效降低ABCG2基因表达水平的质粒进行下一步的慢病毒包装。

1.5 ABCG2 siRNA慢病毒的包装复苏培养293T细胞。培养基为DMEM，含10%FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。每 2～3 天传代 1 次，传代比例为 1∶5～1∶10。慢病毒包装前1天，在100 mL细胞培养瓶中接种293T细胞，用10 mL DMEM完全培养液培养。转染时，细胞密度应为50%～70%。按照说明书操作进行慢病毒包装，取少量浓缩后的病毒液进行滴度测定。剩余的浓缩后病毒液按需要分装，保存于-80℃。

1.6 实时荧光定量PCR及Western blotting检测ABCG2 siRNA慢病毒感染细胞后ABCG2 mRNA及蛋白的表达变化后续实验分为4组，分别为：正常胎盘滋养细胞+ABCG2 siRNA组、正常胎盘滋养细胞+对照siRNA组、子痫前期胎盘滋养细胞+ABCG2 siRNA组、子痫前期胎盘滋养细胞+对照siRNA组。子痫前期及正常胎盘滋养细胞培养后72 h，细胞完全铺展开，以细胞滋养层细胞为主，为未分化状态，在该时间点收集各组培养细胞，分别感染ABCG2 siRNA慢病毒及对照siRNA慢病毒，感染后48～72 h裂解细胞检测ABCG2 mRNA及蛋白的表达水平。原代培养及处理胎盘绒毛滋养层细胞，提取各组细胞的RNA进行逆转录反应，实时荧光定量PCR及Western blotting检测各组细胞ABCG2 mRNA及蛋白表达水平，具体步骤同作者前期研究[8]。实验重复3次，结果取平均值。

1.7 酶联免疫吸附测定（ELISA）检测ABCG2 siRNA慢病毒感染后滋养细胞β-hCG水平实验分组、原代培养及处理胎盘绒毛滋养层细胞同1.6，分别感染ABCG2 siRNA慢病毒及对照siRNA慢病毒，隔日更换并收集细胞培养上清液，按照试剂盒说明分组ELISA检测第2、4、6、8、10天上清液中的β-hCG水平。根据标准品的浓度及对应的光密度值，计算对应的样品浓度。分别检测3次取平均值。

1.8 统计学方法应用SPSS 22.0软件对数据进行分析。定量资料正态分布的数据用均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用两独立样本均数的t检验，多组间比较采用单因素方差分析及重复测量数据的方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ABCG2 siRNA合成及慢病毒表达载体的构建和干扰效果验证

2.1.1 细胞 RNA 提取 A260/A280为 1.9～2.1，取 1 μg样品，进行1%琼脂糖凝胶电泳，80 V，10～15 min。

2.1.2 实时荧光定量PCR及Western blotting检测293T细胞转染不同siRNA表达载体后对ABCG2表达水平的影响 分别以293T细胞组ABCG2 mRNA及蛋白表达水平为1，各组ABCG2 mRNA及蛋白表达水平见表1。干扰后各组均可降低ABCG2 mRNA及蛋白的表达，其中pSRL-SIH1-H1-GFP-ABCG2 siRNA2表达载体ABCG2 mRNA及蛋白表达水平的下降程度最为显著，分别降低至0.16及0.13，故选择该质粒进行下一步的慢病毒包装。

表1 293T细胞中转染ABCG2 siRNA表达载体后ABCG2的相对表达水平 （±s）

表1 293T细胞中转染ABCG2 siRNA表达载体后ABCG2的相对表达水平 （±s）

注：a与组 1比较，P＜0.05；b与组 2比较 P＜0.05；c与组 3比较，P＜0.05；d与组 4比较，P＜0.05；e与组 5比较，P＜0.05。

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2.2 ABCG2 siRNA慢病毒感染子痫前期和正常胎盘滋养细胞后ABCG2 mRNA及蛋白的表达变化

2.2.1 细胞RNA提取 A260/A280为1.8～2.1，取1 μg样品，进行1%琼脂糖凝胶电泳，80 V，10～15 min。

2.2.2 实时荧光定量PCR及Western blotting检测各组细胞ABCG2 mRNA及蛋白的表达水平 如果分别以正常胎盘滋养细胞+ABCG2 siRNA组即siRNA干扰ABCG2表达后正常胎盘滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白表达水平为1的话，未予干扰的正常胎盘滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白的相对表达平均值分别为5.12及10.51，未予干扰的子痫前期胎盘滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白的表达分别为12.47及25.09，干扰后ABCG2 mRNA及蛋白的表达分别降为2.29及3.45。见表2。

2.3 ABCG2 siRNA慢病毒感染子痫前期和正常胎盘滋养细胞后不同分化时期β-hCG的变化应用ELISA分别检测siRNA干扰ABCG2表达前、后滋养细胞第 2、4、6、8、10 天上清液中的 β-hCG 水平。结果显示，无论干扰前后，子痫前期滋养细胞分泌βhCG水平均显著高于正常；干扰后，正常及子痫前期滋养细胞不同分化时期分泌β-hCG水平均降低。RNA 干扰前第 2、4、6、8、10天，正常滋养细胞分泌hCG 水平分别为干扰后的 1.28、3.08、2.69、3.06 及1.80倍，子痫前期滋养细胞hCG水平分别为干扰后的 2.59、2.25、3.52、4.52 及 2.58 倍，干扰后子痫前期滋养细胞hCG分泌下降程度尤为显著，明显低于正常，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表2 siRNA干扰前、后正常及子痫前期胎盘滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白相对表达量 （±s）

表2 siRNA干扰前、后正常及子痫前期胎盘滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白相对表达量 （±s）

注：a与组1比较，P＜0.05；b与组2比较，P＜0.05；c与组3比较，P＜0.05；d与组 4比较，P＜0.05。

组别 n mRNA表达量 蛋白表达量正常胎盘滋养细胞+ABCG2 siRNA组（组1） 3 1bcd 1bcd正常胎盘滋养细胞+Control siRNA组（组2） 3 5.12±0.74acd 10.51±0.65acd子痫前期胎盘滋养细胞+ABCG2 siRNA组（组3） 3 2.29±0.31abd 3.45±0.34abd子痫前期胎盘滋养细胞+Control siRNA组（组4） 3 12.47±1.04abc 25.09±1.95abc F 182.745 325.394 P 0.000 0.000

3 讨论

ABCG2最初是从阿霉素高度耐药的MCF7乳腺癌细胞系中克隆，分子质量75 ku，因其是ABCG家族的第2个成员，又被称为ABCG2。除最初发现的在母胎界面的屏障作用外，越来越多的研究关注其与妊娠并发症的关系[4]。鉴于胎盘滋养细胞浸润能力受损，造成“胎盘浅着床”在子痫前期发病机制中的重要作用，又因妊娠的特殊性及伦理限制，无法体内研究不同阶段及疾病状态下滋养细胞分化及其功能的改变，所以体外细胞系模型是主要的替代途径之一。笔者前期研究中在原代培养的子痫前期滋养细胞中发现不同分化时期ABCG2的表达均高于正常[8]。β-hCG可反映胎盘滋养细胞的分化及功能，与子痫前期有关，妊娠早期hCG升高可增加子痫前期风险[10]。本研究基于以上研究基础，应用RNAi技术使ABCG2表达沉默后，对比研究ABCG2的表达对子痫前期及正常胎盘滋养细胞分泌β-hCG的影响。

本研究通过siRNA预测工具结合相关文献选取3个ABCG2基因的siRNA靶位点，合成3对互补的shRNA序列，转化质粒，转染ABCG2高表达的293T细胞系后通过实时荧光定量PCR及Western blotting检测确定干扰最有效的siRNA，与另外两个siRNA的干扰效果差异有统计学意义（P＜0.05），可使ABCG2 mRNA及蛋白表达水平均降低至正常（分别为0.16和0.13），进行慢病毒包装并感染滋养细胞，成功使ABCG2基因表达沉默，有效降低滋养细胞ABCG2基因的表达水平，应用此ABCG2 siRNA慢病毒感染子痫前期和正常胎盘滋养细胞后，通过实时荧光定量PCR及Western blotting检测原代培养的子痫前期及正常胎盘滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白的表达变化。结果显示无论干扰前后，子痫前期滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白的表达都高于正常，与笔者前期研究结果一致[8]。干扰前，子痫前期及正常滋养细胞ABCG2 mRNA的表达分别为干扰后的5.45倍及5.12倍，蛋白的表达分别为干扰后的7.27倍及10.51倍。干扰后滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白的表达均显著下降，说明实验所用方法成功对滋养细胞细胞进行RNAi，使ABCG2表达沉默，抑制了ABCG2 mRNA及蛋白的表达。

本研究发现β-hCG水平在滋养细胞分化后开始升高，在培养后第6天左右达高峰后逐渐下降，无论干扰前、后子痫前期滋养细胞β-hCG水平均高于正常。目前关于子痫前期患者hCG升高机制尚不明确，Panwar等[11]研究发现，子痫前期患者血清β-hCG水平明显高于正常妊娠者，且与病情严重程度呈正相关。子痫前期胎盘缺血缺氧，局部合体滋养细胞变性坏死，随后出现细胞滋养细胞反应性增殖、分化，在72 h内迅速转变为合体滋养细胞，进一步合成及释放hCG[12]。hCG参与调节滋养细胞的增殖、分化，可促进细胞滋养细胞融合及向合体滋养细胞分化，降低子宫动脉血流阻力[13]，hCG/黄体生成激素（LH）受体基因表达于子宫内皮细胞、子宫螺旋动脉平滑肌及胎盘周围血管，hCG与此受体结合发挥促进胎盘新生血管形成，保证妊娠期子宫及胎盘充足的血供[14]。另外hCG促进巨噬细胞抑制因子或巨噬细胞迁移抑制因子，减少胎盘子宫界面巨噬细胞的吞噬作用，防止胎盘胎儿面组织受破坏，抑制免疫排斥，hCG还使调节性T细胞、白细胞介素10（IL-10）、子宫自然杀伤细胞等正常表达，促进免疫耐受和血管生成[15]。故笔者认为子痫前期患者胎盘合成及释放hCG增多是疾病状态下机体的一种代偿机制，对维持滋养细胞分化、螺旋小动脉形成等胎盘正常血供，抑制炎症免疫过度激活等均有重要作用，一定程度上可抑制子痫前期的发生、发展，降低疾病的严重程度。本研究发现ABCG2表达沉默则滋养细胞分泌β-hCG降低，子痫前期滋养细胞尤为显著，认为ABCG2的正常表达是维系滋养细胞正常分泌βhCG的条件之一，子痫前期滋养细胞ABCG2表达高于正常，为子痫前期β-hCG水平增高的原因之一，可通过导致β-hCG升高以达到前述抑制子痫前期发展的作用。

表3 ABCG2 siRNA慢病毒感染后滋养细胞分泌β-hCG水平 （IU/L，±s）

表3 ABCG2 siRNA慢病毒感染后滋养细胞分泌β-hCG水平 （IU/L，±s）

注：a与组 1比较，P＜0.05；b与组 2比较，P＜0.05；c与组 3比较，P＜0.05；d与组 4比较，P＜0.05。

组别 n Day2 Day4 Day6 Day8 Day10正常胎盘滋养细胞+ABCG2 siRNA 组（组 1） 3 5.63±0.85d 23.23±0.91bcd 52.82±1.76bcd 35.29±2.19bcd 11.78±1.98bcd正常胎盘滋养细胞+Control siRNA 组（组 2） 3 7.23±0.46d 71.49±0.68acd 141.89±2.6acd 108.05±5.78acd 21.25±1.79acd子痫前期胎盘滋养细胞+ABCG2 siRNA 组（组 3） 3 7.30±1.27d 55.25±2.23abd 102.42±4.11abd 58.26±0.99abd 16.56±0.37abd子痫前期胎盘滋养细胞+Control siRNA 组（组 4） 3 18.92±1.03abc 124.39±2.62abc 360.16±17.13abc263.27±3.87abc 42.78±3.64abc F 125.817 1 633.853 688.602 2 333.723 109.529 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

综上所述，笔者在前期研究发现原代培养的子痫前期滋养细胞不同分化时期ABCG2 mRNA及蛋白的表达均显著高于正常[8]的基础上，进一步探究其原因。继续在前期建立的体外原代培养滋养细胞系中通过RNAi技术，成功将ABCG2 siRNA转染至滋养细胞，使ABCG2基因表达沉默，各干扰组的β-hCG水平均低于各对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明滋养细胞ABCG2表达降低可导致滋养细胞分泌β-hCG下降，而无论干扰前、后子痫前期滋养细胞分泌β-hCG水平均高于正常，推测子痫前期ABCG2升高可促进滋养细胞分泌hCG，为保护性的代偿反应，进而有助于抑制病情进展。