徐 勋，卢 艳，赵冰冰，姚德生，伍光腾，董婷婷，冯一鸣，马秀珍，龙 颖

宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，其发生、发展与人乳头瘤病毒（HPV）感染密切相关[1]。在宫颈癌的病理类型中，鳞状细胞癌约占85%，腺癌约占10%~15%，鳞腺癌约占3%[2]。宫颈癌的治疗主要为手术、放疗和化疗，晚期患者疗效不理想，然而多数患者确诊时已为中晚期[3-4]。明确宫颈癌发生、发展机制是治疗宫颈癌的关键。基质金属蛋白酶2（MMP-2）是由Liotta等[5]在高度转移的鼠肿瘤移植培养液中首次发现的，被认为是肿瘤细胞侵袭及转移过程的关键酶。其通过降解细胞外基质，促进新生血管的形成，调节细胞间的黏附等作用，从而促进肿瘤发生侵袭和转移。现有研究显示在人体肿瘤细胞中大概率检测到了MMP-2表达的升高，并且与肿瘤的进展、预后有关。已经有大量的研究结果证实随着宫颈癌病变的进展，MMP-2的表达呈上升趋势，其表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移及肿瘤的预后密切相关[6-8]。但MMP-2对宫颈癌细胞的增殖、凋亡和侵袭的影响以及在细胞中的表达未曾报道。本研究稳转MMP-2沉默慢病毒到宫颈癌SiHa细胞中，通过细胞功能学实验观测MMP-2对SiHa细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响，并建立裸鼠模型，观测其对裸鼠成瘤能力的影响，探讨MMP-2对宫颈鳞癌SiHa细胞生物学行为的作用，从而为宫颈癌的诊断和治疗提供可能的靶点。

1 材料与方法

1.1 研究材料宫颈鳞癌SiHa细胞、MMP-2沉默慢病毒转染试剂购自上海吉凯基因化学技术有限公司，胎牛血清、DMEM培养基购自美国GIBCO公司。cDNA反转录试剂盒、聚合酶链反应（PCR）试剂盒购自大连TaKaRa公司，MMP-2抗体购自美国Abcam公司，IX51型荧光显微镜购自日本Olympus公司，BALB/C裸鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。

1.2 细胞培养和转染将宫颈鳞癌SiHa细胞接种于6孔板中，在37℃、50 mL/L CO2条件下，用DMEM（含 10%胎牛血清）进行培养，随机选取其中处在对数生长期的细胞，分别转染MMP-2基因沉默病毒（MMP-2-LV组）和其阴性对照病毒（NC-LV组）。转染72、96 h后显微镜下观察结果，转染96 h后荧光最强，转染后经嘌呤霉素筛选的6～7 d收获细胞。

1.4 蛋白质印迹（Western blotting）检测细胞中MMP-2蛋白表达首先取MMP-2-LV组和NC-LV组宫颈鳞癌SiHa细胞提取蛋白，用BCA法测定各组细胞蛋白的浓度，蛋白变性后上样，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电脉（SDS-PAGE），然后转至PVDF膜，再室温封闭2 h；抗体孵育：1×TBST洗涤3次后，相应加入一抗稀释液（稀释倍数为1∶100）稀释后的一抗离心管中，在4℃下孵育过夜取出用1×TBST洗涤3次后加入二抗（稀释倍数为1∶1 000）避光孵育1 h。最后用凝胶成像仪观测条带，并用Image J软件分析条带灰度值计算各条带对应的蛋白表达量，重复实验3次。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖能力选取MMP-2-LV组、NC-LV组对数期的SiHa细胞100μL（细胞密度为3000个/孔）接种入96孔板后，置于37℃恒温培养箱培养，分别在24、48、72 h后向每孔加入10 μL CCK-8工作液，并置于培养箱中培养95 min后用酶联免疫检测仪检测（以450 nm为吸收波长，620 nm为参比波长）各孔吸光度值（OD值），记录结果，并据此用GraphPad Prism 5绘制细胞生长曲线，实验重复3次。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡用适量胰酶（无EDTA）消化、收集转染验证成功后的2组宫颈癌SiHa细胞，1 500 r/min离心5 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤重悬细胞后加入1×的Binding Buffer 500 μL、APC Annexin Ⅴ和 7-ADD 各 5 μL 混匀制成细胞悬液，室温反应15 min后置于冰上，40 min内送流式细胞仪上机检测细胞凋亡率，上机前用尼龙网过滤混匀后的细胞悬液，实验重复3次。

1.7 Transwell实验检测细胞迁移能力各取MMP-2-LV组和NC-LV组对数期的宫颈鳞癌SiHa细胞消化、离心、重悬制成单细胞悬液，调节细胞终密度为3×105个/mL。下室加入500 μL的DMEM培养基（含10%胎牛血清），把小室置入24孔板。上室加入100 μL细胞悬液，培养18 h后。用棉签把上室细胞清除，以4%多聚甲醛固定穿入下室的细胞15 min、以0.1%结晶紫对细胞进行染色。倒置显微镜下拍照并计数穿膜细胞数，实验重复3次。

1.8 Transwell实验检测细胞侵袭能力各取MMP-2-LV组和NC-LV组细胞融合度为85%的宫颈鳞癌SiHa细胞洗涤、消化制成单细胞悬液，调节细胞终密度为1×106个/mL备用。将在-20℃冰箱保存的Matrigel基质胶置于4℃冰箱中解冻后，用DMEM培养基稀释（稀释倍数1∶8）制成混合液，移液枪吸取其中85 μL加入Transwell小室上室底部，并置于恒温培养箱中形成凝胶，在Transwell小室上室中加入100 μL细胞悬液，下室加入500 μL DMEM培养基（含20%胎牛血清），把小室置入24孔板中，常规培养24 h。用棉签将上室的细胞清除、用4%多聚甲醛固定穿入下室的细胞16 min，并用0.1%结晶紫将其染色，最后用水洗净、晾干。显微镜下拍照后计数穿膜细胞数，实验重复3次。

1.9 裸鼠成瘤实验各取对数生长的MMP-2-LV组和NCLV组宫颈鳞癌SiHa细胞，用PBS重悬细胞后，分别接种到2组裸鼠中（4～5周龄BALB/C裸鼠，共12只，体质量14～17 g，本实验符合动物伦理学规定），每组6只。从裸鼠腋下脊柱旁皮下注入，接种量为150 μL/只（1×107个细胞）。5～8 d后相继触摸到裸鼠皮下结节，之后每4 d用尺子测量瘤体长径（D）和短径（d），并按照公式体积（V）=D×d2×0.5（D、d以 mm 为单位）计算肿瘤体积。注射后的第5周处死裸鼠，快速分离皮下瘤体并拍照。

1.10 统计学方法采用SPSS 20.0进行统计分析。符合正态分布的定量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本均数的t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光显微镜下观察慢病毒对细胞转染效果构建好的慢病毒分别转染宫颈鳞癌SiHa 72 h后，分别用明场和荧光观察并拍照各组细胞同一视野的细胞转染情况，随机选择5个视野拍照对比观察发现2组绿色荧光蛋白（GFP）表达的细胞在各组中的比例均大于85%，因此认为SiHa细胞被成功转染，见图1（见后插一）。

2.2 转染后2组SiHa细胞中MMP-2 mRNA和蛋白的表达实时荧光定量PCR检测结果显示，MMP-2-LV组MMP-2 mRNA的相对表达量为0.230±0.011，NC-LV 组为 0.883±0.015，MMP-2-LV组低于NC-LV组，差异有统计学意义（n=3，t=63.310，P=0.000）。

Western blotting实验结果显示，MMP-2蛋白相对表达量为 0.718±0.026，NC-LV 组为 1.234±0.084，MMP-2-LV组低于NC-LV组，差异有统计学意义（n=3，t=10.135，P=0.001）。见图 2。

图2 Western blotting检测转染MMP-2沉默慢病毒后宫颈鳞癌SiHa细胞中MMP-2蛋白的表达变化

2.3 沉默MMP-2对SiHa细胞增殖、凋亡、侵袭能力及迁移能力的影响CCK-8法结果显示，MMP-2-LV组细胞增殖倍数为1.03±0.02，NC-LV组为1.20±0.01，MMP-2-LV组细胞增殖倍数低于NC-LV组，差异有统计学意义（n=3，t=16.214，P=0.000），见图3A（见后插一）。

MMP-2-LV组（n=5）细胞凋亡率为（12.83±4.08）%，NC-LV 组（n=4）为（6.06±0.75）%，MMP-2-LV组高于NC-LV组，差异有统计学意义（t=3.232，P=0.014），见图 3B（见后插一）。

Tranwell侵袭实验结果显示，MMP-2-LV组细胞穿膜数为（34.80±1.79）个，NC-LV组为（88.40±6.11）个，MMP-2-LV组穿膜细胞数较NC-LV组少，差异有统计学意义（n=5，t=-18.833，P=0.000），见图3C（见后插一）。

Transwell迁移实验显示，MMP-2-LV组（n=4）穿膜细胞数为（438.50±146.52）个，NC-LV 组（n=5）穿膜细胞数为（759.00±183.00）个，MMP-2-LV 组穿膜细胞数较NC-LV组少，差异有统计学意义（t=2.834，P=0.025），见图 3D（见后插一）。

2.4 裸鼠成瘤实验MMP-2-LV组和NC-LV组的裸鼠成瘤率为100%，第37天处死小鼠取瘤、测量显示，MMP-2-LV组裸鼠肿瘤的体积平均为（63.99±18.76）mm3，NC-LV组裸鼠肿瘤的体积平均为（309.06±67.69）mm3，MMP-2-LV 组小于 NC-LV 组，差异有统计学意义（2组的第1只为预实验小鼠，统计样本量 n=5，t=7.801，P=0.000），见图 4（见后插一）。

3 讨论

宫颈癌是女性常见的生殖系统恶性肿瘤，据世界卫生组织（WHO）统计，全球每年宫颈癌新发病例约52.9万，死亡病例约27万，其中90%在发展中国家[9]。近年，我国宫颈癌的发病率居女性恶性肿瘤第2位，且呈上升趋势[10]。因此，宫颈癌的治疗和诊断一直是妇科肿瘤的研究重点。

现有研究显示在多种实体瘤中均检测到了MMP-2表达升高，且与肿瘤的进展、预后相关[11]。Damodharan等[12]研究发现结肠癌组织中MMP-2表达活性增加，释放生长因子从而促进结直肠癌的增殖生长。Shen等[13]研究发现正常胃黏膜组织中MMP-2的表达水平低于胃体癌组织，而无淋巴转移者的胃癌组织中MMP-2表达量低于伴有淋巴结转移者，在TNM分期中MMP-2表达随分期的升高而增高。Toren等[14]研究发现MMP-2在膀胱癌组织中呈高表达，而在正常膀胱组织或膀胱良性肿瘤中不表达或者低表达，且MMP-2的表达与膀胱癌有无淋巴结转移和临床分期密切相关。在MMP-2与宫颈癌关系的研究方面，已经有大量的研究结果证实随着宫颈病变的进展，MMP-2的表达呈上升趋势，故大胆推测MMP-2充当宫颈癌的“致癌因子”。

为了研究MMP-2对人宫颈癌生物学特性的影响，本研究转染MMP-2沉默病毒于人宫颈鳞癌SiHa细胞，由PCR和Western blotting验证转染成功后，对比观察其与阴性对照组之间CCK-8、Transwell的侵袭、迁移、凋亡和裸鼠成瘤的实验结果，结果显示，MMP-2沉默组相较于阴性对照组的侵袭和转移能力明显降低，而细胞凋亡率升高，细胞增殖率有所降低。因此，推测MMP-2促进宫颈癌的发生、发展主要是通过促进癌细胞的侵袭和迁移来实现。肿瘤细胞的侵袭性行为也对肿瘤的进展发挥了重要作用，而在不断地研究肿瘤细胞侵袭性行为时发现，血管生成与实体瘤的转移及快速增长密切相关，而血管内皮生长因子（VEGF）在这个过程中发挥着重要作用[15]。有研究发现MMP-2在刺激多种肿瘤细胞侵袭、迁移方面与VEGF关系密切[16-17]。Lamoreaux等[18]和Zucker等[19]的研究表明，VEGF与肿瘤的侵袭和转移相关，可能是通过VEGF刺激MMP-2的表达和抑制金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）的表达实现的[20]。

总之，在细胞功能实验方面，沉默MMP-2抑制了宫颈鳞癌SiHa细胞的侵袭、迁移、增殖能力并促进其凋亡；在体外裸鼠成瘤实验中抑制其皮下成瘤能力及肿瘤生长，而MMP-2很可能通过与VEGF的相互作用促进宫颈鳞癌细胞迁移和侵袭。MMP-2可能是宫颈鳞癌的“致癌因子”和潜在的治疗靶点，为未来靶向治疗宫颈鳞癌提供了一定的理论依据。