丁 丽， 吴 旸， 李 培， 林东昉

肠球菌属革兰阳性菌，广泛存在于环境以及人、动物消化道内，能够在高盐（6.5% NaCl）、碱性（pH 9.6）、40%胆汁培养基、10～45 ℃等环境下生长，对多种环境具有高度耐受性，有助于其在不同的宿主内定植并在环境中持久存在。根据肠球菌利用糖类及其分子生物学特征可将肠球菌分为粪肠球菌、屎肠球菌、鸟肠球菌和坚韧肠球菌等[1]。肠球菌是一种重要的条件致病菌，能够造成严重的腹腔感染、尿路感染以及血流感染等。根据2018年中国CHINET 细菌耐药监测结果显示，肠球菌在革兰阳性菌引起的医院感染中排第二位，仅次于金黄色葡萄球菌[2]。由于肠球菌对头孢菌素类药物天然耐药，对氨基糖苷类药物敏感性亦不高，治疗肠球菌感染的药物选择空间小。肠球菌感染的致病机制复杂，其中毒力因子是主要的机制之一，相关的毒力因子主要包括肠球菌表面蛋白Esp、明胶酶GelE、丝氨酸激酶SprE、聚集性物质asa1及细胞溶素（cytolysin）等[3-6]。另外生物膜作为细菌一种独特的毒力因子，参与致病过程，在应对外界环境压力、持续性感染中都起重要的作用。近年来，在许多肠球菌感染中观察到生物膜，包括泌尿道感染、伤口感染、胃肠道感染和感染性心瓣膜炎[7-8]。生物膜相关的肠球菌感染不仅难以根除，而且还作为细菌进一步传播的源头和耐药基因的储库。

虽然这些毒力因子在肠球菌致病过程中的重要性显著，但目前国内关于细菌生物膜形成和调控机制的研究仍然较少。本文报道了临床无菌体液分离肠球菌生物膜形成能力及其毒力基因携带率，分析生物膜的形成能力与毒力基因间的相关性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集复旦大学附属华山医院2015－2017年临床分离肠球菌，标本来源于血、胆汁和腹水等，已剔除同一患者相同来源重复标本。OG1RF（生物膜阳性菌株）作为生物膜形成能力阳性对照。

1.2 主要试剂与仪器

脑心浸液琼脂（BHIA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）购自英国OXOID公司，1%结晶紫染料购自北京索莱宝科技有限公司，Taq酶购自天根生化科技有限公司，琼脂糖、电泳系统及凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品。

1.3 方法

1.3.1 结晶紫染色法 参照文献 [9]中的方法检测肠球菌生物膜形成能力并稍作修改。将冻存菌株接种于哥伦比亚血琼脂平皿，37 ℃过夜培养后挑取菌落于0.9% NaCl 3 mL，制备0.5麦氏浊度菌悬液，随后用TSB将菌悬液1∶200稀释，制备含菌TSB液体培养基1 mL，将制备好的含菌液体培养基接种至Costa3599 96孔板中，每孔200 μL，每株菌3个复孔，37℃静置培养24 h。24 h后弃去菌液，用1×PBS轻轻洗去浮游菌，每孔加入PBS 200 μL，清洗3遍；晾干后每孔用200 μL甲醇，固定10 min；弃去甲醇后，每孔加入100 μL结晶紫染料，染色15 min；流水冲洗后晾干，加入200 μL 33%乙酸脱色10 min，随后用酶标仪测量光密度D570nm。OG1RF作为阳性对照菌株，不加菌液的肉汤作为阴性对照。

1.3.2 DNA模板制备 将冻存菌株转种至哥伦比亚血琼脂平皿， 37 ℃过夜培养后挑取菌落至已注入500 μL TE （pH 8.0） 的1.5 mL Eppendorf离心管，调节菌液浊度至2麦氏单位，100 ℃加热10 min，12 000 r/min离心10 min后取上清液备用。

1.3.3 生物膜相关基因检测 采用表1中引物进行PCR扩增[10-11]，检测临床分离株中的esp、gelE、sprE、asa1、cylA、cylB、cylM基因。PCR体系为25 μL，引物终浓度为1 μmol/L，DNA模板2 μL。PCR反应条件：95 ℃ 3 min ；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶，电压6 V/cm电泳25 min后染色读取结果。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primers used in PCR assay

1.3.4 明胶酶活性检测 参照文献 [13]中的方法并稍作修改，将分离物接种到含有12%明胶营养肉汤的管中。37 ℃温育24～72 h，4 ℃冷藏15 min后读取结果。产生明胶酶的细菌即使在冷藏之后也会使培养基液化，阴性测试显示冷藏后的完整明胶培养基。

1.3.5 结果分析 使用GraphPad Prism 6对数据进行分析，粪肠球菌毒力基因携带率与生物膜阳性率之间的比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。使用GraphPad Prism 6、Excel对数据进行绘 图。

2 结果

2.1 临床分离肠球菌来源分布

共收集1 1 2 株肠球菌菌株，其中5 2 株（46.43%）为粪肠球菌， 60株（53.57%）为屎肠球菌，菌株来源及分布情况见表2。

表2 112 株肠球菌来源及分布情况Table 2 The source of 112 enterococcal strains[n（ %）]

2.2 细菌生物膜形成能力分析

参照文献报道，利用D570nm值将生物膜划分为：阴性 （D570nm＜0.5），弱阳性（0.5≤D570nm＜1）， 中等阳性（1≤D570nm＜2）以及强阳性（D570nm≥2）。 OG1RF作为阳性对照，文献报道D570nm范围为0.5～1。结果见表3、表4。研究结果显示：粪肠球菌相比屎肠球菌更易形成生物膜，两者阳性率分别为63.46%和13.33%，差异具有统计学意义（P＜0.001）。其中，38.46%粪肠球菌可形成中等阳性至强阳性的生物膜。

表3 52 株粪肠球菌形成生物膜的能力Table 3 The capacity of biofilm formation in 52 strains of E. faecalis

表4 60 株屎肠球菌形成生物膜的能力Table 4 The capacity of biofilm formation in 60 strains of E. faecium

2.3 毒力基因筛查

通过PCR方法，在52株粪肠球菌分离株中分别检测了esp、gelE、sprE、asa1、fsrA、fsrB、fsrC以及细胞溶素基因cylA、cylB、cylM的携带率，见图 1。因本研究中屎肠球菌生物膜阳性菌株较少，故筛查最常见的两种毒力基因为esp和gelE，基因携带率分别为65.00% 和10.00%。

2.4 毒力基因与生物膜相关性分析

在52株粪肠球菌分离株中，esp、asa1、cylA、cylB、cylM和fsrB的基因携带率在粪肠球菌生物膜阳性和阴性菌株之间的差异具有统计学意义（P＜0.05），携带这些基因的菌株更易形成生物膜。而gelE、sprE、fsrA、fsrC基因携带率在粪肠球菌生物膜阳性和阴性菌株之间差异无统计学意义，见表 5。

图1 2015－2017 年华山医院粪肠球菌毒力基因携带率Figure 1 Frequency of virulence genes in E. faecalis isolates from 2015 to 2017 in Huashan Hospital

表5 粪肠球菌毒力基因与生物膜形成能力之间的相关性分析Table 5 Correlation between virulence genes and capacity of biofilm formation in E. faecalis

2.5 明胶酶活性分析

对临床分离粪肠球菌进行明胶酶活性测定，共有1 5 株能够液化明胶，推测能够产生明胶酶。统计分析发现明胶酶阳性率在肠球菌生物膜阳性和阴性菌株之间差异无统计学意义（P=0.054 1）。

3 讨论

研究结果显示，粪肠球菌形成生物膜的能力高于屎肠球菌，分别为63.46%与13.33%（P＜0.001），低于欧洲地区报道的肠球菌生物膜阳性率（60%～90%），高于我国Zheng等[12]报道的47.2%阳性率。肠球菌形成生物膜的能力可能具有地域差异。本研究中，血液分离出的粪肠球菌生物膜阳性率为25.00%，胆汁分离出的粪肠球菌阳性率为17.30%，腹水分离出的粪肠球菌生物膜阳性率为19.23%，不同标本来源的粪肠球菌在生物膜形成能力方面的差异无统计学意义。

粪肠球菌被认为是留置医疗器械感染最常见的肠球菌菌种。Esp是一种细胞壁相关蛋白，已被证实是导致泌尿道细菌定植、细菌持续存在和生物膜形成的重要因素。Duprè等[14]研究显示屎肠球菌esp携带率较粪肠球菌更高（71.9%比60%）。本研究结果与之相符，屎肠球菌esp携带率为65.00%（39/60），粪肠球菌esp携带率为40.38%（21/52）。有研究显示esp对生物膜形成具有影响，在粪肠球菌尿路感染（UTI）模型中，Esp缺陷菌株显示初始附着减少[15]，膀胱定植减少，这是因为Esp可结合纤维蛋白原和胶原等配体，并且这些配体存在于膀胱中[16]。本研究也证实esp基因的携带率在粪肠球菌生物膜阳性和阴性菌株之间的差异具有统计学意义（P＜0.05），然而生物膜表型在粪肠球菌和屎肠球菌中的差异性，提示屎肠球菌中esp可能不是其生物膜形成的主要因素。

gelE在不同来源的分离株中广泛存在，但各种研究显示该基因通常沉默，并且归因于体内和体外条件之间的差异，或者不存在表达所需的其他基因。本研究中，粪肠球菌的gelE、sprE与生物膜表型之间不存在相关性，这与Saffari等[17]报道的结果相同，与Zheng等[12]报道的结果相反，这可能与标本来源不同有关，本研究中标本全部来自无菌体液，而Zheng等[12]研究中的菌株主要分离自尿液（203/240）。

细胞溶素在动物感染肠球菌模型中被证实与心内膜炎以及眼内炎有关，由cylA、cylB、cylM等基因编码。本研究检测了粪肠球菌中cylA、cylB、cylM基因携带率，分别为46.15%、48.08%、50.00%，分析结果显示，这3种基因携带率在粪肠球菌生物膜阳性和阴性菌株之间的差异具有统计学意义（P＜0.05），携带cylA、cylB、cylM基因的菌株更易形成生物膜。另外，本研究显示asa1和fsrB基因携带率在粪肠球菌生物膜阳性和阴性菌株之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

近年来，学者们一直在研究耐药与毒力、生物膜之间的关系。有报道显示红霉素耐药肠球菌相较敏感菌株更易形成生物膜[18]。本研究并未发现红霉素耐药与生物膜阳性率之间的相关性，但发现esp、cylA、cylB、cylM基因的携带率在高浓度庆大霉素、红霉素耐药和敏感菌株之间的差异具有统计学意义（数据尚未发表），具体机制需要进一步研究探讨。

总之，本研究显示粪肠球菌较屎肠球菌更易形成生物膜；在粪肠球菌分离株中发现多种毒力基因与生物膜形成相关，这提示生物膜的形成并不是由单一基因调控，而是由多个基因多系统调控。本文报道的肠球菌临床分离株生物膜和毒力基因的比较分析结果，可作为进一步研究肠球菌感染发病机制的基础。