高　越

复方黄芪白术药对的发酵研究

高越

（衡水学院河北衡水053000）

复方黄芪白术是常用的中药药对，黄芪、白术均为补气类中药，都能起到免疫调节作用，在畜牧业应用广泛。用枯草芽孢杆菌发酵黄芪白术药对，采用蒽酮-硫酸法测量发酵前后的多糖含量，以多糖含量为指标设计正交试验。试验结果表明，发酵时间4 d、接菌量4％、含水量50％、发酵温度32 ℃是最佳发酵条件，该条件下发酵复方黄芪白术的多糖含量为18.32％，与发酵前相比提高了44.59％。

黄芪白术药对；中药发酵；枯草芽孢杆菌；多糖

中草药作为饲料添加剂在畜牧业中具有广泛的应用前景，与抗生素类添加剂相比具有毒副作用小、无耐药性、无残留、经济环保等优势，在动物保健、提高畜禽生产性能、改善畜禽产品质量和提升饲草料品质等方面具有重要作用[1]。传统中药炮制方法效率较低，利用微生物发酵中草药，更容易破坏植物细胞壁使细胞破裂，释放其中的活性物质。中药发酵技术能够增加中草药有效成分的利用率，提高药效，降低药物毒副作用，修饰中草药活性成分[2]。

中药黄芪、白术为常用的补气药，二者配对应用，具有较高的研究价值。黄芪、白术具有增强动物免疫力和恢复受免疫抑制动物免疫力的效用，张槐以雏鸡为试验动物，考察试验药物对新城疫疫苗抗体水平的影响，黄芪与白术比例为1:1时，雏鸡ND抗体水平最高，具有较好的免疫增强作用[3]。本试验用枯草芽孢杆菌对复方黄芪白术进行发酵，研究发酵后主要活性成分多糖的含量变化情况，为中药发酵技术在畜牧养殖业中的应用提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

黄芪、白术、枯草芽孢杆菌由衡水学院发酵工程实验室提供，葡萄糖、乙醇、LB培养基、蒽酮、浓硫酸、盐酸等试剂购于衡水瑞丰化玻仪器有限公司。

1.2 仪器

紫外可见分光光度计、中药粉碎机、烘箱、电子天平、水浴锅、恒温摇床、双人净化工作台等仪器由衡水学院食品学实验室提供。

2 试验方法

2.1 中草药预处理

黄芪、白术烘干后粉碎过筛，按照黄芪：白术=1：1的比例配比，混合均匀后在超净工作台中紫外灭菌。

2.2 培养基的配制

LB液体培养基：蛋白胨10 gL、酵母提取物5 gL、氯化钠10 gL、去离子水，在121 ℃条件下高压蒸汽灭菌20 min。

2.3 枯草芽孢杆菌种子液的制备

将冷冻保存的枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基，在37 ℃条件下恒温培养48 h，得到枯草芽孢杆菌种子液。

2.4 接种发酵

在种子液中加入适量无菌水充分混合均匀，取出准备好的黄芪白术中药基质，边搅拌边加入菌液中。接种完成后于恒温培养箱中在一定温度下发酵若干天。

2.5 单因素试验

本试验选取发酵时间、接菌量、含水量、发酵温度4 个因素，分析各因素对黄芪白术药对中多糖含量的影响。

2.6 正交试验

在单因素试验基础上，选取发酵时间、接菌量、含水量、发酵温度为试验因素，分别取3 个水平，以发酵后黄芪白术药对的多糖含量为指标，设计L9(34)正交试验。

2.7 多糖含量的测定

绘制葡萄糖标准曲线：配制1 mg/mL葡萄糖标准溶液，分别准确吸取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4 mL该溶液于具塞试管中，分别加蒸馏水使体积为2 mL，加入8 mL新配制的蒽酮-浓硫酸溶液，震荡混合均匀后，各试管同时沸水浴加热10 min，冷却至室温后，在625 nm处检测其吸光度。根据测量结果以葡萄糖的含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。得到回归方程：=8.301 8 x+0.014 9，相关系数2=0.999 6。

水提醇沉法提取样品中的粗多糖，配制成多糖溶液，准确吸取2 mL多糖溶液于具塞试管中，按制作葡萄糖标准曲线的操作测定625 nm处的吸光度，计算样品多糖含量。

3 结果分析

3.1 单因素试验结果

3.1.1 不同发酵时间对多糖含量的影响

发酵时间分别3 d、4 d、5 d、6 d、7 d时，发酵黄芪白术药对的多糖含量分别为16.21%、17.50%、16.94%、16.03%、15.57%。发酵时间3 d时多糖含量达到最高，之后随时间降低，试验得到最佳发酵时间为3 d。

3.1.2 不同接菌量对多糖含量的影响

接菌量分别2%、4%、6%、8%、10%时，多糖含量分别为15.23%、17.78%、17.11%、16.64%、16.04%。接菌量为4%时多糖含量最高，之后随接菌量的增加而降低，试验得到最佳接菌量为4%。

3.1.3 不同含水量对多糖含量的影响

含水量分别30%、40%、50%、60%、70%时，多糖含量分别为16.83%、17.10%、17.66%、16.83%、15.82%。含水量为50%时多糖含量最高，之后随含水量的增加而降低，最佳含水量为50%。

3.1.4 不同发酵温度对多糖含量的影响

发酵温度分别28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃时，多糖含量分别为14.87%、15.92%、17.45%、17.02%、16.08%。发酵温度为32 ℃时多糖含量最高，之后随发酵温度的升高而降低，最佳发酵温度为32 ℃。

3.2 正交试验结果

以多糖含量为指标，通过正交试验优化枯草芽孢杆菌发酵黄芪白术药对的工艺。正交试验的测定结果见表1，显著性分析见表2。

表1　正交试验对多糖含量测定结果的影响分析

表2　正交实验对多糖含量测定结果影响的显著性分析

分析表1、表2可知，发酵时间、接菌量、含水量对多糖含量均有显著性影响，各因素对多糖含量影响的强弱顺序为：发酵时间＞接菌量＞含水量＞发酵温度。确定各因素的最优组合为A3B2C2D2，即优化的发酵工艺为：发酵时间4 d、接菌量4％、含水量50％、发酵温度32 ℃。

3.3 验证试验

以最优发酵工艺组合A3B2C2D2进行三组验证试验，三次结果取平均值，测得发酵后复方黄芪白术药对的多糖含量为18.32％，与正交试验的最高值17.56％相比提高了4.33%。与未经发酵的复方黄芪白术多糖含量12.67％相比提高了44.59％。

4 讨论

通过正交试验确定了枯草芽孢杆菌发酵复方黄芪白术的最佳条件为：发酵时间4 d、接菌量4％、含水量50％、发酵温度32 ℃。在该条件下发酵复方黄芪白术，测得多糖含量为18.32％，与发酵前相比提高了44.59％。结果表明，通过微生物发酵技术可以有效提高复方黄芪白术药对的多糖含量。发酵中草药应用在畜牧业中，具有无残留、低毒性、经济环保等优势。黄芪多糖和白术多糖具有增强动物机体免疫力、提高动物生长性能、调节机体代谢的作用，在动物生产中应用广泛[4-5]。应用微生物发酵技术发酵复方黄芪白术药剂，可以有效提高其主要活性成分多糖的含量，从而达到提高药效及利用率的效果。

[1]池永宽,刘旭光,熊康宁,等.中草药饲料添加剂应用研究进展[J].中国野生植物资源,2020(9):57-63.

[2]艾素,汤伟,郭若琳,等.微生物发酵中草药及其活性物质的研究进展[J].中国中药杂志,2019(6):1110-1118.

[3]张槐.复方芪术颗粒的研制及其免疫增强作用研究[D].扬州:扬州大学,2019.

[4]史洪涛.黄芪-枯草芽孢杆菌发酵制剂的制备及其在肉鸡上的应用研究[D].郑州:河南农业大学,2014.

[5]胡晓蕾,胡迎利,汪以真.白术及白术多糖对SD大鼠生长性能和免疫功能的影响[J].中国兽医杂志,2016(1):2-6.

衡水市科技计划项目，复方黄芪白术药对微生物发酵研究（NO：2019014029Z）

10.3969/j.issn.2095-1205.2020.12.11

R289.1

A

2095-1205(2020)12-22-02