范英子 王 丹 周 琴 杨向贵 白婷婷 许 颖

(成都医学院第一附属医院检验科，成都 610500)

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一组病因和发病机制尚未明确，反复发作累及胃肠道的非特异性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病。其中溃疡性结肠炎是结肠黏膜层和黏膜下层连续性炎症，常累及部位为末端回肠、结肠和肛周。受遗传、环境和微生物因素相互影响，关键因素为免疫功能紊乱[1，2]。结肠息肉(Colonic polyps)也为常见结肠病变之一,根据病理组织学可分为炎性息肉、腺瘤性息肉和增生性息肉，其中腺瘤性息肉与结肠癌的发生发展有着密切的关系，目前常用的检测手段和治疗方法为电子肠镜[3，4]，肠黏膜免疫调节异常可导致常见结肠息肉的发生。辅助性 T 细胞(helper T cells,Th细胞)及相关因子的调节参与黏膜炎症的多种免疫应答，传统观点认为结肠相关病变主要是由Th1细胞分泌的干扰素γ(Interferon-γ，IFN-γ)介导，与Th2细胞分泌的IL-4等细胞因子无关。近年来，国内外研究发现Th17细胞极化可能是炎症性肠病的发病机制之一[5，6]。Th17细胞的分化调节在人源细胞或组织中与IL-1β和IL-6等细胞因子有关,Th17细胞分泌的IL-17可以清除特定的细胞外病原体,起到抗感染保护作用,与自身抗原的特异性结合又可导致炎症性自身免疫疾病[7，8]。本研究筛选成都医学院第一附属医院诊断为结肠息肉和溃疡性结肠炎患者的病历资料，收集实验室检查结果，在蛋白和转录水平上检测外周血中辅助T细胞内外的相关细胞因子检测,并进行相关的统计学分析，为临床诊疗工作提供一定的理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂 酶联免疫吸附试剂盒：人IFN-γ 酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒，人IL-4 ELISA试剂盒，人IL-17 ELISA试剂盒(购自北京达科为)；RNA的提取试剂盒：RNAprep Pure血液总RNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)、逆转录试剂盒:HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR；qPCR预混液：ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixDNA聚合酶预混液(均购自南京诺唯赞生物科技有限公司)；流式抗体：均购自BioLegend公司，FITC anti-human CD4/PE anti-human IL-4/PE anti-human IL-17/PE anti-human IFNγ；佛波酯(PMA)购自Sigma公司，IFN-γ-F：GAGAACCCAAAACGATGCA，IFN-γ-R：ACTTCTTTGGCTTAATTCTCTCG，IL-17-F：CAACCGATCCACCTCACCTT，IL-17-R：GGCACTTTGCCTCCCAGAT，IL-4-F：AACAGCCTCACAGAGCAGAAG-AC，IL-4-R：GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT，ROR-F：GAGGAAGTGACTGGCTACCAGA，ROR-R：GCACAA-TCTGGTCATTCTGGCAG，T-bet-F：CCGTGACTGCC-TACCAGAAT，T-bet-R：TCATGCTGACTGCGCGAAA-C，GATA-3-F：AGGCAGGGAGTGTGTGAACT，GATA-3-R：TTTTTCGGTTTCTGGTATGG，以上引物均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

1.1.2主要仪器 高速低温离心机：SORVALL RC 6+Centrifuge购自ThermoFisher scientific；酶标仪：Multiskan Mk3购自Thermo SCIENTIFIC；流式细胞仪购自BD FACSCalibur，PCR仪购自美国HACH公司。

1.2方法

1.2.1研究对象 将2017年08月到2018年08月期间在成都医学院第一附属医院就诊的111例结肠病变患者纳入研究，其中男性72例，女性39例，平均年龄(44.32±9.26)岁，其中结肠息肉患者60例，溃疡性结肠炎患者51例，所有患者均经电子肠镜检查，近1个月内均无妊娠，无家族性遗传病史。选择同期45名健康体检者作为正常对照组，其中男性26例，女性19例，平均年龄(43.18±7.73)岁，结肠息肉组、溃疡性结肠炎组及正常对照组在年龄、性别构成上差异均无统计学意义(P>0.05)，本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2.2ELISA检测外周血相关细胞因子蛋白表达水平 采集健康人群及患者清晨空腹外周血3～5 ml，非抗凝采血管，ELISA方法检测外周血血清各细胞因子的含量，并进行分析。使用前，充分混合所有试剂，避免产生泡沫。加样：100 μl/well 加入稀释后的 Cytokine standard 至标准品孔，100 μl/well 加入样品至样品孔，100 μl/well加 Dilution buffer R (×1)入空白对照孔。盖上封板膜，室温(18～25℃)孵育2 h。洗板：扣去孔内液体，300 μl/well 加入 1×washing buffer；停留1 min后弃去孔内液体。重复3次。加检测抗体：100 μl/well 加入稀释后的 Biotinylated antibody。盖封板膜，室温孵育1 h。加酶：100 μl/well 加入 Streptavidin-HRP。盖上封板膜，室温孵育30 min。显色：100 μl/well 加入TMB，室温避光温育5～30 min，根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应。终止反应：100 μl/well加入 Stop solution 终止反应。读板：终止后用检测波450 nm和校正波长630 nm。将零孔设为对照。根据标准曲线和稀释倍数计算浓度。

1.2.3流式细胞术检测外周血Th1/Th17/Th2细胞亚群 全血中加入适量的PMA后混匀，于5%CO2孵箱中37℃放置2～4 h。每管加入红细胞裂解液避光孵育10 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，洗涤细胞后重复离心。加入适量FITC-CD4抗体,室温下避光孵育20 min，洗涤离心后加入固定剂，室温避光孵育20 min离心，弃上清，加入打孔剂，再洗涤。分别加入PE-IL-4/PE-IL-17/PE-IFNγ，避光孵育20 min，洗涤重悬，上机进行检测。

1.2.4RT-PCR检测外周血Th细胞分化相关转录因子和细胞因子的表达 人外周血总RNA的提取：全血中加入红细胞裂解液后冰上孵育15 min，在孵育中涡旋振荡混匀2次。 4℃ 2 100 r/min离心10 min后去上清。 向白细胞沉淀中加入红细胞裂解液重悬细胞，再离心去除上清。向白细胞沉淀中加入裂解液RL，重悬后将溶液转移至过滤柱CS中，12 000 r/min离心2 min，弃去过滤柱CS，收集滤液。向滤液中加入1倍体积70%乙醇混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2中，12 000 r/min离心30～60 s，倒掉废液，将吸附柱CR2放回收集管。向吸附柱CR2中加入去蛋白液RW1，12 000 r/min离心30～60 s，倒掉废液，将吸附柱CR2放回收集管中。再向吸附柱CR2中央加入DNase Ⅰ 和去蛋白液RW1，离心后倒掉废液，再向吸附柱CR2中加入漂洗液RW，室温静置2 min后离心，重复漂洗1次。将吸附柱CR2转入新的RNase-Free离心管中，加入RNase-Free ddH2O室温放置2 min，离心后得到RNA。

RNA逆转录和qPCR：RNA逆转录反应体系：模板RNA：1 pg～1 μg；5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix：4 μl；加RNase free ddH2O至总体积为20 μl。反应条件：50℃ 15 min,85℃ 5 s。 qPCR反应体系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl；Primer1 (10 μmol/L) 0.4 μl，Primer2 (10 μmol/L) 0.4 μl，Template DNA/cDNA(模板体积不超过反应总体积的1/10)，加ddH2O至总体积为20 μl。反应条件：预变性 95℃ 30 s；循环反应：95℃ 10 s，60℃ 30 s；融解曲线：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。

2 结果

2.1正常人群和结肠病变患者外周血中Th细胞相关细胞因子的表达水平 和健康人群相比，结肠息肉组血清中的IL-4表达量低于正常对照组(P=0.031)，而溃疡性结肠炎的表达量高于正常对照组(P=0.038)，差异均具有统计学意义，两结肠病变组别之间无差异(P=0.256)。健康人群IL-17的表达量为(6.017±1.527)pg/ml，和两结肠病变组相比，差异均无显著的统计学意义，其中溃疡性结肠炎组的表达量为(6.741±1.766)pg/ml(P=0.293)，溃疡性结肠炎组的表达量为(5.426±1.633)pg/ml(P=0.484)。IFN-γ的结果提示，相比较健康人群，结肠息肉组和结肠炎组的表达均显著升高，差异具有明显的统计学意义。其中结肠息肉组表达量为(4.045±1.874)pg/ml(P=0.049)，结肠息肉组的表达量为(5.815±2.955)pg/ml(P=0.015)(图1、表1)。

图1 各组血清中细胞因子的表达水平Fig.1 Level of cytokines in serum of each groupNote:*.P<0.05;NS.No significant.

表1 各组外周血Th细胞相关细胞因子表达水平pg/ml)

流式细胞术分析外周血Th细胞亚群分布，发现结肠息肉组CD4+/IL-4+T细胞百分比与正常组相近，而溃疡性结肠炎患者的比例显著升高，[P=0.003，(10.198±2.325)% vs (1.126±0.285)%]，具有统计学意义。和健康人群相比，溃疡性结肠炎组CD4+/IL-17+T细胞百分比升高趋势明显[P=0.009，(9.152±1.932)% vs (1.785±1.066)%]，具有显著的统计学差异。外周血CD4+/IFN-γ+的T细胞比例在正常组和结肠病变组中的差异均无统计学意义(图2，表2)。

图2 各组血清中细胞因子的表达水平Fig.2 Level of cytokines in serum of each group

表2 各组外周血中Th1/Th17/Th2细胞亚群的百分比

2.2性别对结肠病变患者的Th细胞相关细胞因子水平的影响 结果提示：结肠息肉女性患者的血清中IL-4、IL-17水平略高于男性患者，差异均无显著统计学意义(P>0.05)；女性患者血清中IFN-γ的表达量相较于男性患者有所降低，差异无统计学意义。溃疡性结肠炎女性患者和男性患者血清中IL-4、IFN-γ表达水平相似；而女性患者的血清中IL-17的表达水平低于男性患者，差异具有统计学意义(P=0.035)(图3)。

图3 不同性别的结肠病变患者血清中细胞因子的表达水平Fig.3 Level of cytokines in serum of colonic disease patients in different sexNote:*.P<0.05;NS.No significant.

如表3所示：正常人群外周血Th1/Th17/Th2细胞比例无显著的性别差异；在结肠息肉患者中，男性患者外周血CD4+/IL-4+T细胞百分比高于女性患者，而CD4+/IL-17+T细胞百分比在女性患者中有所升高，两者差异均无显著的统计学意义，CD4+/IFN-γ+T细胞的百分比在男性和女性患者中相似；溃疡性结肠炎女性患者外周血CD4+/IL-17+T细胞百分比显著高于男性患者[P=0.022，(12.356±3.862)% vs (8.503±2.748)%]，差异具有统计学意义，性别对CD4+/IL-4+T细胞和CD4+/IFN-γ+T细胞百分比无显著影响。

表3 各组外周血Th1/Th17/Th2细胞的不同性别中的分布Tab.3 Distribution of Th1/Th17/Th2 cells in different sex in peripheral blood of each group

2.3外周血中Th细胞相关细胞因子在转录水平的表达情况 通过RT-PCR检测发现，结肠息肉组IL-4的mRNA相对表达量低于正常对照组(P=0.028)，溃疡性结肠炎组别高于正常对照组(P=0.009)，差异均具有统计学意义。结肠息肉组IL-17 mRNA水平为(0.376±0.047)，相较于正常人群降低(P=0.025)；而溃疡性结肠炎IL-17 mRNA水平为(46.171±10.328)，相较于正常人群显著升高(P=0.004)。和正常人群相比，外周血IFN-γ的mRNA水平在结肠息肉组中为(1.184±1.191)(P=0.049)，溃疡性结肠炎组中为(5.815±2.955)(P=0.008)，差异均具有统计学意义(图4，表4)。

图4 各组外周血中IL-4/IL-17/IFN-γ和GATA-3/RORγt/T-bet转录因子的相对表达量Fig.4 Relative expression of IL-4,IL-17,IFN-γ in peripheral blood of each group and GATA-3/RORγt/T-betNote:*.P<0.05;**.P<0.01.

表4 各组外周血中Th细胞相关细胞因子mRNA相对表达量

检测与辅助性T细胞分化相关的转录因子，发现结肠息肉患者GATA-3/RORγt的mRNA相对表达量均与正常人群相似；T-bet的mRNA水平在结肠息肉和溃疡性结肠炎中分别为0.687±0.882和1.835±0.987，均与正常对照差异无统计学意义；溃疡性结肠炎中，GATA-3/RORγt的mRNA相对表达量均显著升高，其中GATA-3的mRNA水平为26.530±3.270，RORγt的mRNA水平为38.257±7.680，相较于正常人群差异均具有显著的统计学意义(GATA-3:P=0.001 2，RORγt：P=0.002 6)，(图4，表5)。

表5 各组外周血中Th细胞分化相关转录因子mRNA相对表达量

2.4Th细胞相关细胞因子和中心粒细胞/单核细胞比值的相关性分析 正常人群和结肠息肉、溃疡性结肠炎患者外周血中性粒细胞/淋巴细胞的比值分别为2.002±0.479，3.267±1.115，3.228±0.883，结肠病变患者中性粒/淋巴细胞比值均显著高于正常人群，差异具有显著的统计学意义(P=0.012，P=0.003，图5)。分别对两种结肠病变组外周血IL-4、IL-17、IFN-γ的mRNA水平和外周血中性粒/淋巴细胞进行相关性分析，其中：IFN-γ的mRNA水平在结肠息肉、溃疡性结肠炎组中与外周血中性/淋巴比值均呈正相关(r=0.580；r=0.735，图6)；结肠息肉患者IL-17水平与外周血中性/淋巴细胞比值呈现负相关的趋势(r=0.718)，溃疡性结肠炎患者中为正相关(r=0.744)；两种结肠病变患者IL-4水平和外周血中性/淋巴细胞比值差异无显著的统计学意义(结肠息肉组：r=0.085；溃疡性结肠炎组：r=0.302)。

图5 各组外周血中中性粒细胞和淋巴细胞的比值Fig.5 Ratio of neutrophils and lymphocytes in peripheral blood of each groupNote:**.P<0.01;***.P<0.001.

图6 外周血中性粒/淋巴细胞的比值和IL-4、IL-17、IFN-γ的相关性分析Fig.6 Correlation analysis of neutrophils/lymphocytes ratio and IL-4,IL-17,IFN-γ in peripheral blood

3 讨论

我院结肠息肉患者常见于中老年人群，且出现反复发作病情多变的特点，由于目前我国中老年人结肠镜检查普及率较低，寻找简便快捷的检验手段可有效辅助监测结肠病变患者的治疗效果及病情变化。溃疡性结肠炎临床表现为黏液血便，腹痛，是难治性肠道疾病之一，给患者及家属带来一定的精神压力，辅助性T细胞亚群在UC的发病机制中起到关键作用[9]。基于此，本研究针对Th细胞免疫相关细胞因子在两种常见结肠病变外周血的表达情况进行探讨。Th1细胞是最早被发现的Th细胞亚群，抗原呈递细胞分泌干扰素后作用于原始T细胞的STAT-1，再激活特异性转录因子T-bet，促使原始T细胞向Th1分化。Th1细胞分泌的促炎因子主要为IL-6、IFN-γ，研究表明Thl细胞在介导炎症肠病中起关键作用。促炎反应常局限在肠黏膜局部，迁移至血液循环中导致全身炎症反应的研究甚少；IFN-γ主要由T淋巴细胞和NK细胞分泌，能够抗病毒和抗寄生虫感染，调节免疫细胞增殖和凋亡，双向调节炎症因子的表达[10]。本研究探究结肠息肉和溃疡性结肠炎患者外周血中Th1细胞内外IFN-γ的表达水平，发现：溃疡性结肠炎患者血清中IFN-γ水平高于结肠息肉患者，其蛋白水平和转录水平的表达较为一致，而胞内IFN-γ表达量和T-bet转录水平在溃疡性结肠炎中有所下降，提示在溃疡性结肠炎中胞外升高的IFN-γ可反馈调节Th1细胞的分化,需进一步探究调节机制。结肠息肉的血清IFN-γ水平升高程度低于溃疡性结肠炎，可能与结肠组织的病理类型和病程进展的分期有关，如腺瘤样结肠息肉患者外周血IFN-γ水平反复升高，提示疾病有复发可能[11]。

Th2细胞也是较早发现的Th细胞亚群之一，当抗原呈递细胞分泌IL-4作用于原始Th细胞表面受体后，被激活的STAT6活化特异性转录因子GATA-3，使原始Th细胞向Th2细胞分化。Th2主要分泌IL-4、IL-13等细胞因子。IL-4主要由活化的T淋巴细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞分泌，是一种多向性的免疫调节细胞因子，并且在体内外有一定的抗肿瘤活性[12]。有研究证实IL-4能够抑制Th1细胞的活化，另有学者发现Th1型炎症小鼠模型中用IL-4干预后出现炎症加重的现象，提示IL-4可双向调节Th1反应。本研究中结肠病变患者血清中IL-4水平在不同类型的肠病中具有各自的特点：在溃疡性结肠炎患者中，虽然血清中IL-4含量较低，但是Th细胞胞内分泌的IL-4显著升高，同时转录因子GATA-3表达量显著上调，提示在外周血微环境中，免疫调节主要集中在Th2细胞的分化，其中不排除IL-4对Th1细胞的竞争抑制作用；结肠息肉患者的Th2型免疫应答在细胞内外均受到微弱的抑制。

Th17细胞有助于阐述Th1/Th2细胞分化增殖的异常现象和炎症性肠病发生发展中的病理差异。IL-17是Th17细胞发生发展的主要效应因子，能够联合获得性与先天性免疫系统来促进炎症发生。有研究发现：IL-17在体内外具有多种生物学活性,通过诱导促炎因子(如IL-6)、化学因子(如MCP-1、MIP-2)以及基质金属蛋白酶等促进组织炎症发生[13]。另有研究表明IBD患者的肠黏膜组织中IL-17的表达明显高于正常对照，并且病理组织局部表达高于正常组织；IL-17可促使肠上皮细胞分泌IL-6、IL-8中和IL-17的表达，抑制炎症的发生；也有研究发现抑制IL-17表达反而使炎症加重，可为一种双向调节机制[14]。

本研究中结肠病变组血清中IL-17的含量和健康人群相比无显著差异，但是在转录水平上和IL-4的变化趋势相似，在结肠息肉组中低于正常人群，而在溃疡性结肠炎中显著高于正常人群；可能为不同病理类型的炎症环境有差异，抑或外周血微环境中参与其他Th细胞的激活和分化。是否存在Th2细胞和Th17细胞的相互调节需要进一步验证。溃疡性结肠炎患者中Th17细胞比例显著升高，分化相关的转录因子RORγt表达量也保持较高的水平，这些高表达的Th17细胞在机体循环的趋化途径值得进一步探讨。近年研究发现IL-17主要在结直肠癌组织和肠黏膜固有层淋巴细胞内表达，可上调肿瘤细胞的血管内皮生长因子[15-18]，而溃疡性结肠炎是结肠癌的危险因素之一，研究Th17细胞功能为基于肿瘤血管生成的肿瘤免疫治疗提供治疗。目前对于性别影响外周血IL-17的表达水平的研究甚少，曾有报道在无症状的女性淋病患者胸腺基质中，淋巴细胞生成素与宫颈分泌物的IL-17表达水平呈负相关，本研究中溃疡性结肠炎女性患者外周血IL-17胞内表达水平低于男性患者，性激素是否影响外周血的Th17细胞的分化有待进一步探讨。

外周血中单个中性粒细胞产生的细胞因子远少于单个核细胞，当机体处于炎症状态，中性粒细胞数量明显超过单个核细胞，便具有重要的病理意义。中性粒细胞不仅受促炎因子影响，一定刺激下也可产生多种细胞因子，包括IL-8、TNF-α、巨噬细胞炎症蛋白、IL-1β、IL-10、集落刺激因子等。本研究中，两种结肠病变患者外周血中IL-4的mRNA水平与中性/淋巴比例的相关性较弱，可能与IL-4多向性的免疫功能有关，后续研究中，分析肠系膜淋巴结的Th细胞更有助于综合评估Th细胞的系统性免疫应答。IL-17参与中性粒细胞的增殖、成熟和趋化作用，本研究中结肠病变组的IL-17在转录水平上和外周血中性粒细胞的数量存在较强的相关性：结肠息肉中，中性粒细胞分泌的IL-8等在转录水平上抑制了Th17细胞的增殖；溃疡性结肠炎中，IL-17随着中性粒细胞增多而表达增强，发挥促炎作用，体现了其双向调节功能。辅助性T细胞在炎性结肠病变患者中的作用机制目前尚不明确，但可以初步判断Th1/Th17/Th2细胞在外周血中相互调节、相互抑制，分泌的多种细胞因子是一个动态平衡过程，其中Th17细胞更易发挥双向调节作用。炎症性结肠病变病因复杂，其发生发展与辅助性T细胞的分化方向和细胞因子网络失衡有一定联系，深入探讨Th细胞的免疫微环境的调节，揭示其免疫发病机制，可为预测疾病的进程及合理用药提供新思路。