黄子彧，钟 军，宋 浩，黄德文，戴 彬，戴林建*

(1.湖南农业大学，湖南 长沙 410128；2.湖南省中烟工业有限责任公司，湖南 长沙 410007)

【研究意义】通过单倍体进行良种选育，其中由隐性基因控制的性状,由于没有显性基因的掩盖而容易显现。单倍体植株经染色体加倍后,在一个世代中即可出现纯合的二倍体，从中选出的优良纯合系后代不分离,可缩短育种年限。单倍体育种如能进一步提高诱导频率并与杂交育种等相结合应用，则在作物品种改良上的作用将更显著。组织培养是单倍体育种中应用最广的方式，通过组织培养产生幼苗有两大途径：一是通过愈伤组织的诱导分化，二是通过胚状体诱导。采用胚状体诱导能提高幼苗产生速率，且稳定性高，从而节省了资源，提高了效率[1-7]。【前人研究进展】胚状体诱导频率受多个因素的影响，如基因型、培养基、预处理、培养材料及条件等[6-13]。陈春艳等人认为4 ℃低温预处理48 h能显著提高花药胚状体的诱导率[14]。贾永炯的研究发现在含0.4～0.8 mg/L 2,4-D的Nitsch培养基上,能提高胚状体发生频率[15]。王仲慧[16]、李婷婷[17]等人的研究说明基因型是影响诱导率的一个重要因素。潘莉等人的研究发现，蔗糖浓度及光照强度等对胚状体诱导率也会产生影响[18]。李春玲[13]与王立浩[19]等人对培养基中添加的碳源及其浓度进行了试验，结果发现，3 %的蔗糖对花药的诱导率最高。【本研究切入点】前人的试验多是研究某一或几个因素对花药或叶片诱导频率的影响，鉴于此，作者在前人实验的基础上，通过对花药与叶片作为培养材料在各影响因素下的诱导能力进行比较。【拟解决的关键问题】着重对花药与叶片各自最适生长激素与细胞分裂素的比例及浓度进行探讨，以期为提升烟草胚状体诱导效率提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的烟草杂交品种为钾高效品系与其他抗黑胫病烤烟品种的杂交子一代，杂交组合为①♂净叶黄×♀HKDN-5，②♂HKDN-5×♀革新3号。所有杂交组合于2017年3月移栽至湖南农业大学耘园基地，采用常规田间管理方法，2017年5月下旬开始现蕾。

1.2 基本培养基

花药：1/2 MS + 0.1 mg/L IAA + 0.25 mg/L 6-BA + 3 % 蔗糖 + 0.7 % 琼脂， pH 5.8。

叶片：1/2 MS + 0.1 mg/L IAA + 0.5 mg/L 6-BA + 3 % 蔗糖 + 0.7 % 琼脂， pH 5.8。

1.3 实验设计与方法

1.3.1 无菌材料获得 ①花药：晴天摘取花冠与花萼等长或花冠超出部分不超过花萼1/3的花蕾，4 ℃冰箱中预处理2 d后，将花蕾放入超净台进行消毒。消毒步骤为：先用无菌水冲洗2次；接着用75 %酒精漂洗30 s，后用无菌水冲洗3次；再用20 % NaClO和少量吐温20浸泡15 min，后用无菌水漂洗4次，最后置于无菌滤纸上除湿。用镊子拨开花冠，小心取出花药。②叶片：采用花药离体培养产生的幼苗，经单倍体鉴定后，取上部幼嫩的1～3片叶，切割成0.5 cm×0.5 cm的小块。

1.3.2 基因型与外源激素添加量对胚状体诱导的影响 在基本培养基的基础上加入不同浓度的外源激素IAA与6-BA，每种激素均设0、0.125、0.25、0.5、1.0 mg/L 5个水平。将2种杂交子一代的花药和叶片在各激素水平组合下分别进行培养，每种材料均有25个处理，每个处理重复5次，每个培养皿接种25颗，然后放入25 ℃，光照强度2000 lx，光照时间12 h/d的光照培养室进行培养。

1.3.3 其他因素对烟草胚状体诱导的影响 ①光照。采用品种1的花药和叶片作为试验材料，分别在2000 lx，12 h/d的光照、暗处理10 d后移入光照条件与无光条件3种情况下分别离体培养，每组重复10次，其他条件保持一致。②接种密度。采用品种1的花药和叶片，分别接种10、15、20、25、30、35、40颗于90 mm的培养皿中，各处理均重复5次，培养基条件与光照保持一致。

1.3.4 统计方法 自花药接种后3 d观察其污染情况，及时清除污染的培养皿，在上述各实验条件下培养20 d后统计叶片胚状体的诱导率，45 d后统计花药胚状体的诱导率。

花药(叶片)胚状体诱导率=

愈伤组织诱导率=

2 结果与分析

2.1 不同外植体与基因型对胚状体诱导率的影响

由图1和表1可知，基因型是影响胚状体诱导率的重要因素之一，不同基因型之间花药胚状体的诱导率有极显著的差异，在本试验中品种1的花药胚状体诱导率达34 %，品种2诱导率仅为15 %，相差19 %。而二者的叶片胚状体诱导率分别为24 %与17 %，相差虽只有7 %，但依然有显著差异。对愈伤组织的诱导则不同，2种基因型之间的诱导率无较大差异。但同一基因型下，花药与叶片之间，无论愈伤组织还是胚状体，均有极显著的差别，说明不同外植体和诱导率之间有更紧密的联系。

表1 不同基因型对胚状体诱导的影响

注：不同大写字母为差异达显著水平(P<0.01)，小写字母为差异达显著水平(P<0.05)，下同。

Note:The uppercase letter indicated significant difference at 0. 01 level. Lowercase letter indicated significant difference at 0. 05 level. The same as below．

1.♂净叶黄×♀HKDN-5，2.♂HKDN-5×♀革新3号1.♂Jing ye huang×♀HKDN-5，2.♂HKDN-5×♀Ge xin No.3图1 不同基因型的花药和叶片诱导率的差异Fig.1 Differences in embryoid induction rate result from different genotypes

表2 不同激素浓度对胚状体诱导的影响

2.2 培养基成分对胚状体诱导的影响

2.2.1 外源激素浓度对胚状体诱导的影响 如表2所示，外源激素浓度对烟草胚状体诱导有极显著的影响。不加激素有约8 %的外植体能被诱导出胚状体并形成小苗，加入0.125～0.5 mg/L的外源激素后，能使胚状体的诱导率普遍提升，提升幅度在5 %～38 %，加入1 mg/L的激素时，胚状体的诱导率较不加激素时无明显提升作用；而愈伤组织的诱导率却有较大提升，最大提升了43 %。对于花药培养而言，25组处理中共有6组产生了愈伤组织，以添加0.25 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA为界，在此浓度下，花药愈伤组织诱导率为5 %，在0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA浓度条件下愈伤组织诱导率达到34 %。当生长素浓度与细胞分裂素浓度出现极大差异或仅添加其中1种激素时，花药依然倾向于开裂后形成胚状体，而非愈伤组织。对于体细胞培养来说，25组处理均产生了愈伤组织,也均有胚状体产生。且2种激素添加浓度相差越大，越倾向产生愈伤组织。

表3 不同激素比例对胚状体诱导的影响

2.2.2 不同激素比例对胚状体诱导率的影响 由表3可知，不同激素比例之间的诱导率差异变化更加显著，IAA与6-BA的比例为1∶1或1∶2时，花药胚状体诱导率明显高于其他比例，品种1的诱导率最大可达54 %。当二者比例超过1∶4时，诱导率极显著下降，平均诱导率下降至10 %～21 %。对于叶片而言，当激素比例为1∶2或1∶4时，平均出胚率显著高于其他比例，最大能达到41 %。且不同品种间的最适比例也有差别，品种1的花药在IAA：6-BA为1∶2时具最高胚状体诱导率，而品种2的花药最适激素比例是1∶1。说明外源激素添加比例也对胚状体诱导有着显著影响，且与品种之间存在相互联系。

2.3 其他因素对胚状体诱导率的影响

2.3.1 光照对胚状体诱导的影响 通过光照与黑暗条件下诱导率差异的对比实验(图2)发现，花药胚状体在光照条件下诱导率为40 %，无光条件下诱导率为36 %，诱导10 d后将黑暗中的一部分移入光照条件下，诱导率为48 %。说明对花药而言，进行一段时间的暗处理可以在一定程度上刺激花药胚状体的萌发。叶片在光照条件下的胚状体诱导率为36 %，无光条件下诱导率为48 %，诱导10 d后将黑暗中的一部分移入光照条件下，诱导率为58 %，说明无论是10 d暗处理，还是进行20 d的暗培养均可提高叶片胚状体的萌发，但胚状体萌发后若不及时移入光照环境下，对幼苗的生长不利，易形成白化苗，植株瘦弱，生长速度大幅减缓。

2.3.2 接种密度对胚状体诱导的影响 图3和表4表明，花药胚状体的诱导率并不会随着密度的提高而出现明显增加。但随着密度的提高，诱导出胚状体的花药在总数上是低密度的1.2倍，提高花药密度有利于节约资源与成本。与花药培养不同的是，对于体细胞而言，随着接种密度增大，胚状体的诱导率有上升趋势。当接种密度上升到每培养皿40颗时，胚状体的诱导略有下降，说明密度过高也会抑制胚状体的产生。

表4 密度对烟草体外培养的影响

3 讨 论

对烟草胚状体诱导效率的影响因素进行研究，结果表明基因型是影响烟草诱导出胚状体的重要因素之一，基因型与外源激素间存在相互联系，不同基因型的胚状体萌发率有极大的差别。材料也是影响胚状体诱导效率的因素[20]，花药与体细胞之间，花药的诱导效率高，数量多，一次性能获得大量胚状体，有利于优良性状的表达。但采用体细胞作为诱导材料时不受时间控制，易于获得，节省时间成本，且在适宜的条件下也有较高的诱导效率。

激素是调控植物生长的重要物质[21]。本试验的结果说明，添加0.1～0.5 mg/L IAA与0.25～0.5 mg/L的 6-BA的培养基上，胚状体诱导频率较不添加激素时，能得到显著提高。但激素浓度升高到一定程度后(1 mg/L)反而会使花药和叶片更加倾向形成愈伤组织，而非形成胚状体，这在花药胚状体的诱导中更为明显。这与慕平利[22]的研究结果一致。激素的比例也会对胚状体的诱导率造成影响，不同基因型之间的最适比例并不相同，当生长激素与细胞分裂素处于1∶2或1∶1时，花药萌发率最高，当二者比例为1∶4时，叶片胚状体诱导率最高。综上所述，采取较低的外源激素浓度能避免形成愈伤组织，提升胚状体的诱导可能性，保持其适当的比例能提高获得的效率。

除此之外，接种密度也会使诱导率产生差异，孙夕等[23]的研究表明，在一定范围内花药密度与诱导率呈正相关，超过一定范围则无较大影响。本试验结果说明花药密度与诱导率之间并无明显正相关，出现这一结果的原因可能是花药的接种密度还没有到达临界值，花药间的间距仍然较宽，并未出现群体效应；或者花药密度增大虽诱发了群体效应但培养基营养水分供给不足，导致密度大的处理本应萌发出胚状体的花药停止了萌发，致使最后的萌发总数仍然不高。但接种密度小虽然诱导效率不减，却并不利于节省空间与培养基原料。而体细胞的试验结果说明，在一定程度上接种密度增大能提高胚状体的诱导率，且当每个培养皿接种达到40个时胚状体的诱导率即有所下降。

环境因素也是影响胚状体诱导的重要因素之一。本试验结果说明，光照不是花药或体细胞萌发的必要条件，暗培养或是适当暗培养一段时间后转移至光照条件下，更有利于胚状体的诱导。但是光照也能刺激一些花药或是体细胞萌发成胚状体，且要把握好移入光照的时间，避免产生白化苗。

4 结 论

使胚状体诱导效率提高主要体现在保持较高的胚状体萌发率的情况下，节省时间与成本。本试验结果说明采用体细胞进行胚状体诱导，培养基采用1/2 MS+0.125 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA，每培养皿接种35颗材料，可先在黑暗或弱光条件下培养7～10 d后，再移入光照下培养是高效诱导胚状体的最适条件。