王利妍，郭天杰，石兴云，蒋 宾，念 波，焦文文，王旭东，赵 明，马 燕

(云南农业大学龙润普洱茶学院，云南 昆明 650201)

【研究意义】普洱茶(Pu-erh tea)是以云南大叶种茶树晒青毛茶为原料，经固态发酵(后发酵)等工序加工而成的茶叶产品[1]。陈香显著是普洱茶的重要品质特征，也是决定其价格的重要条件[2]。基于对品质的重要影响以及独特的香气类型，普洱茶香气物质分析得到了学者的广泛关注。【前人研究进展】已有学者分别对普洱茶香气物质组成[3]和微生物[4]对普洱茶香气成分影响等进行了研究。发现普洱茶香气重要特征在于发酵过程中形成了大量的1，2，3-三甲氧基苯、1，2-二甲氧基苯等显陈香的甲氧基苯化合物[5]。已有研究采用同时蒸馏萃取法(Simultaneous-dist extraction，SDE)、顶空固相微萃取 (Headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME) 、减压蒸馏萃取 (Vaccum distillation extract，VDE)和超声波辅助萃取分散液液微萃取 (Ultrasound-assisted extraction-Dispersive liquid-liquid microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，UAE-DLLME)等方法提取普洱茶香气物质。【本研究切入点】可能由于分析成本较高，吕才有[3]、曹艳妮[1,6]、赵苗苗[7]、Xu X[8]、Gong Z[9]等应用同时蒸馏萃取法(Simultaneous-dist extraction，SDE)只进行一次提取分析；李建勋[10]、陈保[11]、张灵枝[12]等应用顶空固相微萃取法(Headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME)也只进行了一次提取分析；仅发现叶静[4]、徐咏全[13]、张文杰[14]和Lv H[15]等人进行了重复提取，其他研究只进行了1次分析或未明确标示，较少关注重现性(Reproducibility )。重现性是评判一个试验数据可信度的重要参数。由于在密闭系统以较高温度萃取时次生反应剧烈[3]，同时蒸馏萃取法(Simultaneous-dist extraction，SDE)的重现性尤其值得关注。然而已有应用同时蒸馏萃取法(Simultaneous-dist extraction，SDE)结合气相色谱-质谱联用技术(Gas Chromatography-mass Spectrometry，GC-MS)对普洱茶香气物质的研究，未进行重复实验，因此有必要从重现性的角度考察评价该方法的准确性。【拟解决的关键问题】应用同时蒸馏萃取法(Simultaneous-dist extraction，SDE)结合气相色谱-质谱联用技术(Gas Chromatography-mass Spectrometry，GC-MS)检测了2次普洱茶发酵的原料(晒青毛茶)和出堆样的香气物质组成，并从物质鉴定重复率(定性)及峰面积精密度(定量)考察该方法的重现性，同时利用电子鼻分析香气变化并进行感官审评，以期为准确认识普洱茶香气形成提供科学知识。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验材料 某茶厂2次普洱茶发酵的原料样品(R1、R2)和出堆样品(P1、P2)。

1.1.2 试验设备及试剂 美国Agilent 7890A-5975C GC-MS 气质联用仪；电子鼻(PEN3) ，北京盈盛恒泰科技有限责任公司；SDE同时蒸馏萃取设备；瑞士BUCHI R-3旋转蒸发仪。二氯甲烷、无水硫酸钠,均为国产分析纯试剂。

1.2 试验方法

1.2.1 同时蒸馏萃取法 准确称取茶样100.0 g，将供试茶样置于同时蒸馏萃取设备内，用二氯甲烷50 mL提取5 h。萃取液用无水硫酸钠干燥、过滤，萃取液用旋转蒸发仪挥干溶剂，挥发油进行称量。用二氯甲烷将挥发油溶解至1.00 mL，用GC-MS进行检测，每个样品提取检测重复3次。

1.2.2 气相色谱-质谱联用技术(Gas Chromatography-mass Spectrometry，GC-MS) 色谱条件为色谱柱：HP7890A-5975C(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：100 ℃保持2 min，以4 ℃/min升温至250 ℃，保持20 min；载体：氦气(He)，进样量为2 μl；采分流比为25∶1。

质谱条件为电子能量70 ev；气质接口温度为280 ℃；离子源温度为230 ℃；电离方程：EI,倍增器电压为1894 v。

根据GC-MS分析得到的各色谱峰，通过检索谱库(NIST11.L)，结合相对保留时间，查阅有关文献数据进行香气物质鉴定，根据香气物质的峰面积值相对定量。

1.2.3 电子鼻与感官审评 电子鼻测定香气方法依照使用说明进行，仪器设置测定时间60 s，取响应信号区间48～51 s进行数据分析。感官审评根据国家标准GB/T23776-2009中茶叶审评方法及对茶样进行感官审评。

1.3 数据处理

应用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/构建VN图，比较物质鉴定重复率，重复率为3次均鉴定的化合物数量/至少1次鉴定到的化合物数量。使用IBM SPSS Statistics及Winmuster软件进行主成分(PCA)分析，HemI软件进行热图分析。

2 结果与分析

2.1 重现性分析

在某茶厂收集了2次普洱茶发酵的原料样品与出堆样品，通过SDE-GC-MS法分别提取检测3次。GC-MS共鉴定出210个化合物，R1、P1、R2、P2的物质鉴定重复率在50.78 %～71.30 %。以R1为例，一共鉴定到的化合物有122个，3次重复都鉴定到的化合物有65个，鉴定到2次的化合物有24个，33个化合物仅鉴定到1次(图1)。以3次都鉴定到的化合物峰面积计算RSD，R1、P1、R2、P2的RSD分别为0.85～52.08 %、1.76 %～70.91 %、1.5 %～67.04 %和0.76 %～7 0.01 %。RSD在0～5 %的化合物有4～14个，在5 %～10 %的化合物有8～22个(图2)。

2.2 样品香气物质组成特征与变化

以4个样品3次重复均检测到的化合物峰面积为指标进行PCA分析，得到累积变量为92.31 %的三维PCA图(图3)。为了验证GC-MS结果，进一步进行电子鼻测定，提取传感器响应信号进行PCA分析，得到累积变量为99.83 %的PCA图(图4)。2次PCA分析，各样品的分布相符。都是R1和R2相聚较近成为1簇，P1和P2聚成不同的簇。说明经过发酵香气物质组成发生显著变化，且该厂2次发酵出堆样品的香气存在差异。

图1 重复鉴定化合物的VN图比较Fig.1 VN diagrams of compounds identified in replicated tests

图2 重复鉴定化合物的峰面积RSD分布Fig.2 RSD of peak areas of compounds identified in replicated tests

本研究一共鉴定到210个化合物，其中3次重复均检测到的有118个，后续以此118个化合物进行分析。从化合物类别看，主要包括醇类、酮类、酯类、醛类等(图5)。原料样以醇类化合物为主，R1、R2相对含量分别为53.3 %和50.0 %，主要包括芳樟醇及其氧化产物、植物醇及α-松油醇等物质；其次是酯类化合物，R1、R2的相对含量分别为14.8 %和12.2 %，主要有二氢猕猴桃内酯、邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二辛酯等物质。出堆样品以杂氧化合物为主，P1、P2相对含量分别为44.0 %和41.5 %，包括1，2，3-甲氧基苯、3，4，5-三甲氧基甲苯及1，2，4-三甲氧基甲苯等；其次是醇类化合物，相对含量分别为24.7 %(P1)和25.7 %(P2)，主要包括芳樟醇氧化物(反式吡喃型)反式芳樟醇氧化物(呋喃) 顺式芳樟醇氧化物(呋喃)等物质。

图3 基于峰面积的PCA分析Fig.3 PCA analysis of peak area

图4 基于电子鼻提取数据的PCA分析Fig.4 PCA analysis of data of electronic nose

对118个化合物峰面积进行热图分析(图6)，发酵前后芳樟醇、邻苯二甲酸二异丁酯等68个物质含量降低，1，2，3-三甲氧基苯及1，2，3，4-四甲氧基苯等50个物质含量增加。其中仅在原料中鉴定到香叶醇、2，6-二甲基环己醇、邻苯二甲酸二异丁酯、二十六烷等32个物质，仅在出堆样品中鉴定到2，6-二甲氧基苯酚、亚油酸、1，2，3，4-四甲氧基苯、庚烯醛等25个化合物。

2.3 感官审评

发酵原料与出堆样品感官审评如表1所示,R1汤色黄明亮，滋味醇正回甘，R2汤色橙黄，滋味浓醇回甘，香气均清香持久；经过发酵，出堆样品汤色转变为红褐(图7)，滋味变为醇和或平和，香气以陈香为主。发酵原料与出堆样品差异显著。该结果与GC-MS和电子鼻分析相符，都表明经过发酵，茶叶内含物质成分及含量发生剧烈变化，从而导致原料与出堆样品在色、香、味等方面的显著差异。

图5 香气物质类别的相对含量Fig.5 Relative content of classification of aroma substances

图6 鉴定物质峰面积的热图Fig.6 Heat map of peak area of identified compounds

表1 茶样感官审评结果

图7 茶样审评图Fig.7 Photography of sensory evaluation of tea leaves

3 讨 论

3.1 SDE-GC-MS重现性

经测定分析，4组样品的物质鉴定重复率为50.78 %～71.30 %，RSD在0.85 %～70.91 %。徐咏全[13]和张文杰[14]利用HS-SPME鉴定化合物的RSD 均小于10 %，谷勋刚[16]应用SDE重复6次RSD 均小于12 %。本文章峰面积的RSD与已有结果差距较大，推测SDE提取中次生反应剧烈，香气成分发生变化。李艳清[17]等研究发现SDE存在长时间高温致物质转化，提取效率低且不能按比例提取，因此该方法得到的精油与实际香气有一定的差距。李建勋[18]研究表明，HS-SPME优于SDE方法用于普洱茶香气物质提取。这些结论与本文章基本一致，表明SDE-GC-MS分析茶叶香气物质时需要增加重复或改进提取方法。但是吕世懂等人[19]发现，不同香气提取方法均存在一定缺陷，今后有待开发灵敏度更高、次生反应更小的方法，研究茶叶香气物质。

3.2 发酵前后香气物质组成与变化

经分析发现，原料样品以醇类和酯类化合物等为主，出堆样品以杂氧和醇类化合物等为主。曹艳妮[6]研究表明，熟茶主要的香气化合物为芳樟醇吡喃氧化物及α-松油醇等物质。赵苗苗[7]发现，晒青毛茶香气物质以醇类及烯烃类物质为主。本文章结果与吕海鹏[20]及等研究的普洱茶香气以甲氧基苯类化合物，醛酮类和醇类为主基本一致。

通过热图分析，经过发酵芳樟醇等68个物质含量降低，1，2，3-三甲氧基苯等50个物质含量增加。张灵枝[12]发现在发酵过程中，醇类和碳氢化合物剧烈减少，酯类和杂氧类化合物成分显著增加。曹艳妮[6]结果表明，α-松油醇、香叶醇及芳樟醇等经过发酵显著下降。其中仅在原料样品中鉴定到香叶醇等32个物质，仅在出堆样品中鉴定到1，2，3，4-四甲氧基苯等25个化合物。与曹艳妮[6]等发现熟茶中独有的1，2，3，4-四甲氧基苯的结论相似。Xu[8]与Gong[9]等发现在发酵过程中，醇类和碳氢化合物剧烈减少，酯类和杂氧类化合物成分显著增加。这些变化规律与以上研究结果近似，即普洱茶发酵过程，醇酯类物质显著减少，甲氧基苯等杂环化合物显著增加。推测这些化合物在发酵过程中或提取过程中发生了降解、转化或新生成，可能与普洱茶发酵过程中剧烈的氧化有关。

4 结 论

本文章研究发现SDE-GC-MS法测定茶叶香气物质的重现性较低，建议增加重复实验次数，或改换提取方法。本文章共检测到118个化合物，从香气物质类别来看，普洱茶发酵原料以醇类为主，发酵后样品甲氧基苯等杂氧化合物相对含量较高；峰面积比较发现，发酵中芳樟醇、植物醇及香叶醇等68个物质含量降低，1，2，3-三甲氧基苯、1，2，4-三甲氧基苯及1，2，3，4-四甲氧基苯等50个物质含量增加。总之，发酵中醇类物质减少，甲氧基苯等杂氧化合物含量增加，进而形成了普洱茶陈香显著的特征。