罗延青，王云月, 赵德胜, 赵凯琴, 周丕才, 符明联, 董云松, 李劲峰,王敬乔*

(1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201；2.云南省农业科学院经济作物研究所，云南 昆明 650205；3.楚雄州农业科学院经济作物研究所，云南 楚雄 675000)

【研究意义】根肿病是发生在十字花科作物上的一种植物病害，在全球范围内广泛发生，对具有重要经济价值的芸薹属作物如白菜、甘蓝和油菜等危害严重[1]。根肿病由芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)引起的，感病植株根部会形成大小不一的根瘤，阻碍植物所需水分和营养物质的吸收和运输，导致植株地上部分出现叶片变黄、植株矮小及萎蔫等症状，严重感病时可导致植株死亡[2]。灌溉、农事操作中农机具混杂使用和附着在种子表面的休眠孢子是根肿病害传播和扩散的主要渠道[3]。近年来，根肿病害在四川、重庆、湖南、浙江、广西等省(市)发生危害日益严重，对十字花科作物造成了重大损失，根肿病防控已成为十字花科作物种植中亟待解决的问题[4-6]。严位中等2004年对云南省根肿病发病情况系统调查发现，全省10个地州(市)均有根肿病的发生[7]。目前，根肿病害已蔓延到全省各油菜主产区，并对油菜生产造成不同程度的损失，严重影响油菜产业的发展[8]。如何有效地控制根肿病的危害和蔓延，是云南省油菜产业发展中亟需解决的难题。【前人研究进展】目前，根肿病主要通过与非十字花科作物轮作或间作、土壤酸碱度的调节、以及使用化学杀菌剂等方法来进行防控[9-10]。根肿病菌的休眠孢子在土壤中能存活多年，适宜条件下就能萌发侵染寄主，导致轮作或间作收效甚微[11]；生产上多采用百菌清、氟啶胺等化学药剂，对根肿病能起到一定的防控效果，但存在生产成本较高以及环境污染等问题[12]。因此，选育根肿病抗病品种是最为经济有效的防控措施[3]。国内外通过研究已获得许多对根肿病表现抗性的种质材料。欧洲饲料芜菁中许多品种如Siloga，Milan White等对根肿病具有抗性，并已应用选育出大白菜抗病品种[13]；此外，Williams鉴别系统和欧洲根肿病鉴别系统中的鉴别寄主对根肿病菌存在抗、感性反应差异，具有生理小种专化抗性，这些材料也可用于根肿病抗性育种[14]。根肿病菌具有生理小种的分化，且存在致病性变异，不同地区的根肿病菌生理小种不同。季海雯等对甘蓝型油菜根肿病病菌进行鉴定，发现有2，4和13号，其中4号小种分布范围最广[6]。沈向群等对辽宁、山东、云南、四川和吉林等5省15个发病区域的根肿病病原菌进行生理小种鉴定，共分别发现2，4，7，10和11号生理小种，云南的为4号生理小种[15]。刘峰等对云南和西藏的根肿病样品进行鉴定，共鉴定出10个生理小种，其中4号生理小种为优势种[16]。丁云花等对云南、湖北、重庆、四川等8个省(市)采集的18份病样进行鉴定，共鉴定到2，4和7号生理小种，在云南鉴定到2号和4号，主要以4号生理小种为主[17]。【本研究切入点】根肿病抗性育种中已选育出一批抗性白菜、油菜品种，但由于所用的抗性亲本材料不同，以及各地区生理小种间的差异，抗性株系仅在一定区域内表现出抗病性；由于云南自身的气候特点，通过引种来进行根肿病防控具有一定的局限性。因此，抗病育种必须针对当地特定的病原生理小种选择合适的亲本[18]。对云南特定的根肿病生理小种，韩国选育的大白菜品种 “康根51”(俗称白菜王)在云南各种植区或对云南采集的病菌表现出较强的抗病性，可作为云南根肿病抗病育种的抗源材料[7,19]。因此，本研究中拟以“康根51”作为抗性亲本，以种间杂交的方式将“康根51”的抗性引入到甘蓝型油菜中，以期创制获得抗(耐)根肿病甘蓝型油菜新种质。【拟解决的关键问题】创制获得对云南特定根肿病生理小种表现抗性的甘蓝型油菜新种质，为油菜根肿病抗病育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

“康根51”为韩国选育的大白菜根肿病抗病品种，10P002、10P005、10159等为云南省农业科学院经济作物研究所创制获得的甘蓝型油菜种质，为根肿病感病材料。

1.2 方法

1.2.1 种质创制过程 以“康根51”为父本，甘蓝型油菜为母本通过人工去雄授粉的方式进行杂交获得F1代种子。室内根肿病抗性初筛后，将未发病植株移栽并套袋或与原甘蓝型油菜亲本进行回交获得杂交后代材料，依此进行后种植于大田，单株自交套袋收种，选择结实率较好的用于抗性鉴定试验，共计663份。

1.2.2 染色体数目观察 以抗性亲本大白菜 “康根51”、甘蓝型油菜10159以及杂交获得的不同世代种子萌发后的根尖为材料进行染色体数目的观察与计数。采用压片法制备染色体标本[20]。选取籽粒饱满的种子，铺放在带有2层滤纸的灭菌培养皿中，加入少量灭菌ddH2O润湿滤纸，并于培养箱中25 ℃暗培养60 h。切下约1 cm 左右的根尖部分，放入0.002 M 8-羟基喹啉中，15 ℃ 40 r/min摇床处理3 h。用清水清洗根尖2～3次，并加入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸/3∶1)，4 ℃过夜。取根尖放入1 M HCl中，60 ℃水浴中水解10 min。清水洗净后，取白色根尖部分在载玻片上，压平根尖，并加入卡宝品红工作液进行染色，10 min后在显微镜下观察、计数及拍照。染色体数目的确认以观察30个细胞以上，85 %以上的细胞具有一致的染色体数目，即可认为是最终染色体数目。

1.2.3 分子验证 采用经筛选获得的在亲本材料间存在差异的2对SSR引物，对构建的抗性种质进行PCR分析，引物为Ra2-A11(5’-GACCTATTTTAATATGCTGTTTTACG-3’和5’-ACCTCACCG-GAGA GAAATCC-3’)和Na10-D09(5’-AACGTCAAGATCCTCTGC-3’和5’-ACCACCACGGTAGTAGAGCG-3’)。PCR反应体系为15 μl，分别为1×PCR缓冲液，2.5 m mol/L MgCl2，正反向引物各20 ng，0.2 m mol/L dNTPs，1UTaq酶，20 ng DNA模板。反应条件为94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共计35个循环。2.5 %的琼脂糖凝胶进行电泳。

1.2.4 大田抗性筛选 选择昆明茨坝和小哨2个多年种植白菜且根肿病严重发病的田块进行抗性评价。每份材料设3个重复，并以“康根51”和甘蓝型油菜“花油8号”(记为H8)(云南省农业科学院经济作物研究所选育的品种)为抗、感病对照，每20份材料设1组对照，在苗期进行病害调查与统计。

1.2.5 室内抗性鉴定 对大田抗性初筛后获得的抗性种质进行室内接种验证。以楚雄州东瓜镇油菜发病根瘤上分离的休眠孢子为病源。休眠孢子按照常规方法稍作修改后进行提取[21]。采用菌土接种法进行接种，具体操作如下：土壤121 ℃高压灭菌30 min，冷却拌匀后重复灭菌1次。土壤称重后进行拌土，使其休眠孢子的密度为5×107～ 1×108个/g土，pH值调节在5.4 ～ 6.5。带菌土壤装入穴盘中，每盘中播种10粒种子，于人工气候箱中进行培养，温度设定为26 ℃。每个材料设3个重复，并以“康根51”和“H8”为抗、感病对照。出苗40 d后，浇足水将植株完整拔出，清洗根部后进行发病统计调查。

1.2.6 病害等级划分标准 病情等级划分标准参考Siemens等[22]的方法进行。分为5个级别，0级：根部无症状；1 级：侧根有肿块，主根无肿块；2级：主根有肿块，侧根无肿块；3级：主、侧根均有肿块；4级：主、侧根有大量严重肿块。

1.2.7 病情指数计算和抗性评估标准 病情指数(disease index，DI)计算公式如下：

抗性评估标准：050，高感(high susceptibility,HS)。

1.2.8 数据统计分析 采用SPSS对发病率和病情指数进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 染色体数目分析

以“康根51”为父本，甘蓝型油菜纯系材料为母本进行杂交创制获得了种间杂交后代材料。为鉴定创制获得的植株是否为真实杂种，以亲本材料“康根51”、10159及其构建的不同世代杂交后代暗培养后的根尖为材料进行染色体数目分析。分析结果显示“康根51”染色体数目为20条(图1A)，10159染色体数目为38条 (图1B)，与理论值相符。甘、白杂交F1代的染色体数目为29条(图1C)，具有与预期相符的染色体数目。进一步分析发现，F3的染色体数目为32条(图1D)，BC2的染色体数目为35条(图1E)。随着世代的增加，染色体数目逐渐趋于正常，在BC4和F4中均发现含有38条染色体及自交结实正常的甘蓝型油菜单株。以上结果表明获得的种质确为以“康根51”为亲本创制的。

2.2 杂交后代分子检验

为进一步验证创制获得的新种质为甘、白杂交的后代材料，采用经筛选获得的在“康根51”和10159中存在差异的SSR标记对创制的种质进行PCR扩增。引物Na10-D09扩增结果显示双亲存在差异，它在“康根51”中扩增到一条大小在250 bp左右的清晰条带，而甘蓝型油菜10159除扩增到该条带外，还具有其它两条清晰条带，F2单株的扩增结果除具有与“康根51”相同的条带外，与亲本10159完全相同，不能由此判定它们是“康根51”和10159的杂交后代；引物Ra2-A11在亲本间存在差异，且F2单株具有双亲共同带型，这表明所创制的种质确为甘、白种间杂交后代(图2)。

2.3 大田抗性筛选

分别在昆明茨坝和小哨2个根肿病发病严重的田块对663份材料在苗期进行病害调查统计。在自然发病条件下，“康根51”基本不发病，H8发病率平均为30.61 %，最高可达56.3 %，供试的663份材料发病率在0～85.5 %(数据未显示)。综合2个点的病害调查结果，2点6个重复中均未发病或发病率较低的材料共有29份(表1)。其中R072等10份种质为F3代材料，R179等17份种质为F4代材料，R384等2份材料为BC1F2代材料。

图1 亲本及不同杂交世代染色体数目分析Fig.1 Numbers of chromosome of parents and different generations

2.4 室内抗性鉴定

采用菌土接种法对大田初筛获得的29份种质进行根肿病抗性鉴定。在人工接种条件下，对照H8发病率为86.7 %，病情指数为64.17，为高感品种。抗性亲本“康根51”发病率为6.7 %，病情指数为5.00，表现为高抗。10P002、10159等甘蓝型油菜纯系亲本材料的发病率在26.7 %～83.3 %，平均发病率为50.43 %，病情指数分别为26.67～70.00，除10P005对筛选所用的根肿病生理小种表现为抗病外，其余皆表现为感病或高感(表1)。

经室内接种验证，29份杂交后代材料中2份材料R150和R322，分别为F3和F4代种质，对楚雄东瓜分离的根肿病生理小种表现为高抗，发病率分别为6.7 %和13.3 %，病情指数分别为5.83和7.50；R072 、R087等19份F3、F4和BC1F2世代材料表现为抗病，发病率在13.3 %～36.7 %，病情指数在10.83～25.80；R085等4份F3和F4代种质材料表现为感病，发病率在30.0 %～66.7 %，病情指数在30.00～45.80；R225等4份F3和F4代种质材料表现为高感，发病率在70.0 %～83.3 %，病情指数在50.83～79.70。

2.5 发病率与病情指数相关性分析

采用SPSS软件对“康根51”与甘蓝型油菜纯系亲本以及其杂交后代材料的根肿病病情指数与发病率进行相关性分析，发病率与病情指数呈极显著正相关(P<0.01，表2)。在图3中，病情指数随发病率的增加而增加，相关公式为y=0.805x+0.556，决定系数R2=0.916。虚线矩形内的为高抗品种(种质)，虚线椭圆形内的为高感品种(种质)。

M：DL2000；1：“康根51”，2：10159，3～7：F2单株M：DL2000；1：‘CR51’，2：10159，3-7：F2plant图2 SSR引物在亲本和F2单株PCR扩增结果Fig.2 The PCR amplification results of SSR primers in parent and F2generation

表1 油菜种间杂交后代根肿病抗性表现

表2 病情指数与发病率相关性分析

2.6 抗(耐)根肿病甘蓝型油菜新种质的创制

以“康根51”为父本，甘蓝型油菜纯系材料为母本进行杂交获得的F1代植株自交结实率较低，经回交或多代自交后获得的种质材料结实趋于正常，田间表型性状与甘蓝型油菜基本一致。通过染色体数目和分子验证，确实为甘、白杂交后代材料。田间抗性鉴定和室内抗性接种验证，共创制获得2份根肿病高抗种质，19份表现为抗病。

3 讨 论

在根肿病抗性研究中，对现有种质资源以及收集的抗病品种和资源进行抗性评价对根肿病抗病育种具有重要作用。为此，国内开展了大量的根肿病抗性鉴定研究工作。四川主栽油菜品种和引进的德国甘蓝型油菜对成都根肿病发病严重区的抗性鉴定中发现，低感品种仅占15.22 %，无抗病品种[4]。陈静等采用室内外抗性鉴定相结合对79份甘蓝新组合进行抗性鉴定，筛选到对重庆市涪陵区根肿病病菌表现高抗的GZ78，有助于培育具有地区特征性的抗性品种[23]。黄晓莉等通过田间自然诱发鉴定、温室和组织培养室内人工接种鉴定等 3 种方法对50个白菜品种进行抗性评价，3种方法的鉴定结果存在差异，其中7个品种经3种鉴定方式均表现为高抗，可以在病区种植[24]。

通过“康根51”与甘蓝型油菜进行杂交，创制了663份甘、白杂交后代材料。经茨坝和小哨2个点的田间抗性初筛获得29份抗性较好的种质，进一步进行室内接种鉴定，共21份表现为抗病，其中R150和R322表现为高抗。田间抗性鉴定的结果与室内抗性结果有差异，造成这种差异的原因可能如下：①田间鉴定受气候、土壤环境和其它病原微生物的影响，且存在根肿病菌分布和数量不均等因素，在不同田块和年度间抗性鉴定结果可重复性稍差；室内抗性鉴定的土壤酸碱度、光照、温度等因素可调控，植株的出苗整齐并且可重复性高，但植物的生长发育与自然条件下存在差异。因此2种方法的鉴定结果会存在不同。②根肿病菌生理小种存在致病性分化，田间的生理小种可能是以复合形式存在的，较室内采用单个根瘤扩繁并分离休眠孢子进行接种而言，田间的鉴定环境更为复杂。田间鉴定更接近于自然条件下根肿病的发生、致病过程，具有生产上的应用价值，单一的任何一种抗性鉴定方法都不能完全真实的反应种质抗病性。因此，对种质材料的抗性鉴定评价宜采取田间抗性鉴定和室内抗性鉴定相结合的方法，才能较为准确的进行抗病性评价。

图3 亲本及杂交后代病情指数与发病率关系Fig.3 Relationship between disease index and disease incidence of parents and hybrid offspring

对染色体数目的分析表明，在白菜和甘蓝型油菜杂交过程中染色体发生了置换，白菜的染色体或染色体的大片段置换到了甘蓝型油菜中。在研究过程中杂交后代结实率较差，究其原因可能一是“康根51”存在自交不亲和现象，二是染色体数目异常。此外，采用在亲本间存在差异的引物进行检测，发现杂交后代具有双亲的互补带型，为“康根51”和甘蓝型油菜亲本杂交创制获得的种质。

根肿病菌生理小种是以鉴别寄主接种病菌后的抗、感病性进行划分的[6,14]，对云南不同地区采集的根肿病样生理小种鉴定表明，云南省存在多种生理小种，其中4号小种为优势种。 “康根51”在云南省的根肿病发病区域具有较好的根肿病抗性，但在室内抗性鉴定中发现，少数植株的根部有微小根瘤，可能为杂合体单株抗性相对较弱。由于田间的病原体是以复合形式存在的，因此要获得在生产上真正具有应用价值的品种，应采用基因聚合的方式将多个外源抗性基因导入到同一种质中，可筛选获得具有多个生理小种抗性的新种质。

4 结 论

以“康根51”和甘蓝型油菜为亲本进行杂交，创制获得663份不同世代的自交单株。经染色体数目分析和分子验证，确定为甘、白种间杂交后代材料。采用田间和室内抗性鉴定相结合的方法，共筛选获得21份根肿病抗性新种质，其中R150和R322表现为高抗。相关性分析表明，根肿病发病率与病情指数呈极显著正相关。