赵宜婷,武丽霞,詹晓平,邓文丽,黄吴莹, 鲁新琪,韩 丽,周 璇,杜云龙*

(1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201； 2.云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南农业大学 云南 昆明 650201；3.云南农业大学农业生物多样性与病害控制教育部重点实验室，云南 昆明 650201)

【研究意义】根系作为植株的地下部分，在植物生长发育过程中起到非常重要的作用。月亮谷(Acuce) 水稻是元阳梯田的特色地方稻，开展植物激素对月亮谷水稻的根系研究，对于揭示激素对水稻根系发育的调控机制具有重要的理论意义，能充分了解根系发育与月亮谷的优异性状之间的内在联系，对开展新品种选育具有重要的应用价值。此外，开展月亮谷水稻根系发育的研究，对提高元阳梯田土地资源的利用、促进粮食增产、保护元阳梯田的持续发展是一个有效的手段。【前人研究进展】生长素在植物根系发育中起到一个核心的作用，许多研究揭示了生长素可调控水稻胚根[1]、不定根[2]和根毛发育。生长素的极性分布对植物发育具有重要作用[3]，水杨酸可通过抑制细胞胞吞而影响生长素的极性运输[4]调节拟南芥下胚轴的发育及向光性[5]。水杨酸(Salicylic acid，SA)作为一种重要的植物激素，广泛参与植物抗病、抗逆、植株衰老、果实成熟、种子萌发、花发育等重要生命过程的调控[6]。水杨酸与水稻生长发育的研究，长期以来集中于其诱导植物系统获得抗性的方面[7]，但一些研究结果显示出水杨酸可能直接或间接参与了对植物根系发育的调控，例如水稻中的OsWRKY03作为依赖于水杨酸或茉莉酸防御反应途径中的一个转录激活物，过表达OsWRKY03明显减少了水稻根发育的起始及伸长[8]。真菌及病毒性病害对水稻生长发育的危害日趋严重[9-10]。月亮谷(Acuce)是云南元阳哈尼梯田上种植面积最大的地方稻，已有100多年的种植历史。月亮谷属于农家水稻品种，研究发现月亮谷水稻具有抗病性强、较强耐冷能力和产量稳定等优异的农艺性状[11]，并具有较高的遗传异质性[12]和居群遗传多样性[13]及遗传变异性[14]。UV-B的辐射可抑制月亮谷叶片的发育[15]，而在月亮谷的根系中能够分离到荧光假单胞菌[16]。【本研究切入点】对月亮谷水稻根系机制的研究还未见相关的研究报道。【拟解决的关键问题】通过研究，将揭示SA与生长素相互作用调控月亮谷水稻根系发育的机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

月亮谷水稻来自云南元阳梯田，为本实验室保存材料。

1.2 实验方法

1.2.1 水稻材料组织培养 月亮谷水稻种子去壳，种子用70 % 无水乙醇表面消毒90 s；无菌水清洗1次，之后用20 % 次氯酸钠溶液浸泡14 min，无菌水清洗5次；用灭菌滤纸将多余水分吸干，将处理好的种子置于1/2 MS培养基中培养。

1.2.2 水杨酸处理月亮谷水稻 种子去壳后，在1/2 MS培养基上黑暗培养2 d至种子萌发。萌发的种子转至含有0.5、1、1.5、2 mM SA的1/2 MS培养基上培养，对照组为含有等量二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)的1/2 MS培养基，种子在28 ℃人工气候箱中进行黑暗8 h和光照16 h的培养，7 d后，对胚根、不定根、侧根进行测量分析。

1.2.3 重力刺激条件下的月亮谷水稻生长 月亮谷水稻种子在28 ℃人工气候箱中黑暗培养2 d后，光照培养4 d。水稻苗转移至含有SA(0.5、1、1.5、2 mM)的1/2 MS培养基上，同时将培养平板逆时针旋转90°，在光照条件下培养18、24、48、72、96 h，观察胚根发育。

1.2.4 月亮谷水稻中生长素运输检测 月亮谷水稻种子在1/2 MS培养基上萌芽1 d后，转至含有DMSO、100 μM SA、5 μM N-(1-萘基)邻氨甲酰苯甲酸[N-(1-Naphthyl) phthalamic Acid，NPA]、5 μM NPA+ 100 μM SA的1/2 MS培养基上，分别测量统计光照培养18、24、48、72、96 h后的胚根长度。

月亮谷水稻种子在1/2 MS培养基上萌芽2 d后，转至含有DMSO、100 μM SA的1/2 MS培养基上，光照培养5 d后，在重力刺激条件下培养18 h，之后取与地面平行的胚根部分，用HPLC-MS/MS的方法检测生长素的含量。

1.2.5 月亮谷水稻根中胞吞观察 月亮谷水稻苗经光照培养4 d后，胚根的根尖用4 μM FM4-64、100 μM SA(等体积DMSO为对照)及 25 μM 布雷非德菌素A (Brefeldin A，BFA)溶液共处理90 min，在激光共聚焦显微镜Leica SP5(所用参数：40倍放大，Zoom: 2，Frame: 4，Agron: 488 nm，)下观察，并用Image J软件测量BFA 小体的大小。

2 结果与分析

2.1 SA对月亮谷水稻根系的影响

为了揭示SA对水稻根系发育的影响，月亮谷水稻用不同浓度SA处理，与经DMSO处理的对照相比，随着SA浓度的增加，月亮谷水稻胚根的生长受到明显抑制(图1)，侧根数量减少(图2)。当SA浓度达到2 mM时，不定根的发育受到明显抑制(图3)，说明SA的处理影响了水稻的根系发育。

P<0.05，**P<0.01 (Student’st-test)，下同。DMSO：DMSO处理；SA 0.5，SA 1，SA 1.5，SA 2：水稻苗分别用浓度为0.5、1、1.5、2 mM的SA处理DMSO treatment; SA 0.5, SA 1, SA 1.5, SA 2: rice seedlings treated with SA at a concentration of 0.5, 1, 1.5 and 2 mM, respectively图1 SA对月亮谷水稻胚根长度的影响Fig.1 Effect of SA on the primary root length of Acuce rice

图2 SA对月亮谷水稻侧根数量的影响Fig.2 Effect of SA on the number of lateral root of Acuce rice

图3 SA对月亮谷水稻不定根数量的影响Fig.3 Effect of SA on the number of adventitious root of Acuce rice

Bar = 1 cm；g：重力，箭头指示重力方向。下同Bar = 1 cm; g: gravity，arrow showed the direction of gravity. The same was below图4 重力刺激下的月亮谷水稻胚根及侧根发育Fig.4 Development of primary root and lateral root of Acuce rice under gravity stimulation

图5 重力刺激下SA对月亮谷水稻侧根密度的影响Fig.5 Effect of SA on the lateral root density of Acuce rice under gravity stimulation

图6 重力刺激下SA对月亮谷水稻根弯曲度的影响Fig.6 Effect of SA on the root curve of Acuce rice under gravity stimulation

2.2 SA改变生长素分布

生长素的极性分布可以影响根系的生长[3]。为了探究SA影响月亮谷水稻根系发育是否与生长素分布有关，月亮谷水稻在含有SA (0.5、1、1.5、2 mM )的1/2 MS培养基生长并经重力刺激(图4)，结果显示随着SA浓度的增加，与地面平行的胚根上，侧根密度明显降低(图5)。与对照相比，在低浓度SA(0.5 mM)处理下，胚根的弯曲开始明显变小(图4，图6)。当SA浓度升高到1 mM 时，胚根的生长与水平面呈平行状态(图4，图6)。说明SA的处理会改变生长素的分布，使得水稻根系的生长发育受到影响。

2.3 水杨酸影响月亮谷水稻根中的生长素运输

为了进一步揭示SA影响水稻根系发育与生长素分布之间的关系，用生长素运输抑制剂NPA处理月亮谷水稻。当采用低浓度SA(0.1 mM)处理水稻时，与经DMSO处理的水稻相比(图7)，胚根的生长没有受到明显的影响(图8)。但是，用生长素运输抑制剂NPA(5 μM)处理后，与用DMSO及SA(0.1 mM)处理的水稻相比(图7)，水稻胚根长度明显变短(图8)。当用NPA(5 μM)与SA(0.1 mM)同时处理水稻时，与经NPA处理的水稻相比(图7)，月亮谷胚根的长度明显伸长(图8)。同时，在重力刺激条件下，水稻经0.1 mM SA处理(图9)，测量水稻胚根中的IAA含量，发现经SA(0.1 mM)处理的月亮谷胚根中的IAA含量明显升高(图10)。这些结果显示SA影响了生长素的运输而调节水稻根系发育。

DMSO：DMSO处理；SA 100：水稻苗用浓度为100μM的SA处理；NPA 5：水稻苗用浓度为5μM的NPA 处理；NPA 5 + SA 100：水稻苗用浓度为 100 μM的SA和5 μM的NPA 同时处理。下同DMSO:DMSO treatment; SA 100: Rice seedlings treated with 100 μM SA; NPA 5:Rice seedlings treated with 5 μM NPA; NPA 5 + SA 100:Rice seedlings treated with 100 μM SA and 5 μM NPA. The same as below图7 不同培养基处理下月亮谷水稻胚根的表型Fig.7 The phenotype of primary root of Acuce rice treated with different media

图8 不同培养基对月亮谷水稻胚根长度的影响Fig.8 Effect of different media on the primary root length of Acuce rice

IAA，测量横向生长胚根中的生长素含量IAA, measurement of auxin content in the horizontal primary root图9 月亮谷水稻重力刺激示意图Fig.9 The schematic diagram of gravity stimulation on Acuce rice

图10 SA处理月亮谷水稻胚根后的生长素含量Fig.10 Auxin content in the primary root of Acuce rice treated with SA

2.4 水杨酸抑制水稻根表皮细胞的胞吞

水杨酸可以抑制网格蛋白clathrin介导的胞吞，从而调节生长素的运输[4]。生长素输出蛋白的不对称分布可以调节生长素的极性分布，从而有利于生长素的运输。在水稻中，生长素输出蛋白相关基因已经被鉴定[2,17-18]。蛋白转运抑制剂brefeldin A (BFA)处理植物细胞后，可抑制膜蛋白的转运而在细胞质中形成BFA小体(BFA body)，并能观察细胞的胞吞[3-4]。为了揭示水杨酸是否通过抑制细胞胞吞而调节生长素运输，月亮谷水稻胚根经水杨酸、蛋白转运抑制剂BFA以及细胞膜染料FM4-64共同处理，在激光共聚焦显微镜下观察根表皮细胞的胞吞(图11)，显示低浓度水杨酸可以明显抑制根表皮细胞的胞吞(图12)。

3 讨 论

激素间的相互作用对于植物的生长发育起到重要的作用。SA参与调控植物的生长发育，但是，SA对根系发育的调控机制并不清楚。研究发现较高浓度的水杨酸能够抑制月亮谷水稻根系的发育，而较低浓度的水杨酸已能抑制月亮谷水稻根中的生长素运输，这与水杨酸抑制根表皮细胞的胞吞密切相关。生长素的极性分布调控根系发育[1]。在重力刺激条件下，水杨酸对胚根弯曲和侧根发育的影响与其浓度呈现相关性，但是，低浓度水杨酸处理已能影响生长素在胚根中的分布，这显示水杨酸改变了生长素的运输。在拟南芥中，观察到水杨酸阻止了根的伸长、侧根的起始和根毛的形成[19]。而水杨酸影响拟南芥根的波动生长可能与水杨酸受体NPR1及一氧化氮相关蛋白AtNOA1有关[20]。但是，试验未观察到水杨酸对水稻根波动生长的明显影响，这暗示水杨酸可通过影响生长素的极性分布而调控根系发育，但水杨酸调控植物根系的生长在单子叶植物水稻和双子叶植物拟南芥上仍存在一定的差异。生长素的极性分布与生长素输出载体蛋白的分布密切相关[3]。SA能够抑制拟南芥根表皮细胞中生长素输出载体蛋白的胞吞，从而改变生长素的运输[4]。在水稻中存在不同的生长素输出载体蛋白，它们可定位于质膜、根冠、中柱鞘细胞、分生组织及侧根原基，其表达及细胞定位受到生长素及其它激素的调控[2,17]。水稻中的生长素输出载体蛋白也可调节生长素在水稻中的分布[2,17-18]。研究结果发现SA的处理抑制了月亮谷水稻根表皮细胞的胞吞，这显示SA对植物细胞胞吞的抑制作用在单子叶与双子叶植物中具有一定的保守性。因此，推测 SA具有抑制水稻中生长素输出载体蛋白胞吞的作用，并改变了生长素运输。考虑到水稻中生长素输出载体蛋白的多样性，还有待检测水稻根中的生长素输出载体蛋白在受到SA影响时的细胞定位情况，以确定水稻中特异生长素输出载体蛋白与SA互作调控水稻根系发育的机理。

Bar：10 μm，箭头指出BFA小体。BFA 25：水稻根用浓度为25 μM的BFA处理；SA 100 + BFA 25：水稻根用浓度为25 μM的BFA和100 μM的SA共同处理Bar: 10 μm, arrow head pointed out the BFA body; BFA 25:rice root treated with 25 μM BFA; SA 100 + BFA 25: rice root treated with 100 μM SA and 25 μM BFA图11 SA抑制月亮谷水稻根表皮细胞的胞吞Fig.11 Inhibition of endocytosis by SA in the root epidermis cells of Acuce rice

图12 不同处理下BFA小体的大小Fig.12 Relative size of BFA body on different treatments

4 结 论

研究结果说明，SA可通过抑制生长素输出载体蛋白的胞吞进而干扰生长素的极性运输，并影响月亮谷水稻的根系发育。