何娅玲

复旦大学生命科学学院，上海 200433

埃可病毒又称人肠道致细胞病变孤儿病毒(enteric cytopathogenic human orphan virus，ECHO)，属于小 RNA病毒科肠道病毒属B组，最早由无菌性脑膜炎患儿粪便中分离获得[1]。临床研究显示埃可病毒感染可导致无菌性脑膜炎、婴儿腹泻等多种疾病,在世界各地人群中散发或流行[2]。对上海水质调查中发现EC30是一种常见的病原[3]。2014年，浙江宁波市郊区出现了由EC30引起的家族式脑膜炎爆发，造成了巨大的社会影响[4]。尽管该类病毒危害较大，但是尚无特效药物用以治疗，也未有预防性疫苗[5]。

肠道病毒属的病毒成员庞杂，病毒颗粒均呈裸露无包膜的球形，直径约24～30 nm，由衣壳和单正股RNA组成[6]。感染人类的可分为A～D 4类[7]，其中也包括手足口病的主要致病原，肠道病毒A类的人肠道病毒 71 型（human Enterovirus 71，EV71）等。 该研究借鉴EV71病毒培养纯化经验，使用RD细胞作为EC30生产细胞。在RD细胞中接种EC30并扩大培养，利用蔗糖密度梯度离心的方法分离、纯化病毒。SDS变性蛋白电泳检测发现目的产物纯度较高，随后用透射电镜观察发现目的产物为20～30 nm大小的球状颗粒。这些均提示纯化产物纯度较高、具有完整的病毒颗粒结构。此外，该病毒颗粒蛋白可在优化条件下成功生长成蛋白晶体，为后续的病毒结构功能研究和疫苗研发建立了坚实的基础，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

RD细胞购自ATCC细胞库；哺乳动物细胞培养基包括DMEM High Glucose培养基购自Gibco公司；胎牛血清、青霉素链霉素双抗溶液购自HyClone公司；蛋白质浓度测定试剂盒购自BIO-RAD公司；病毒颗粒纯化与浓缩、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等实验相关试剂与材料购自AMERSCO、Millipore、国药集团等公司；负染色电镜样品制备相关材料购自中镜科仪；晶体培养条件筛选使用Hampton crystallization kits。

1.2 方法

以下实验均在生物安全二级实验室中进行。

1.2.1 病毒的扩增与纯化 使用DMEM细胞完全培养基[包括 89%（v/v）DMEM High Glucose 培养液，10%（v/v）胎牛血清，1%（v/v）青链霉素双抗]在T75细胞培养瓶及滚瓶中传代培养RD细胞。细胞密度达到80%，EC30病毒以0.1（Pfu number/cell）的感染复数感染细胞。显微镜下观察90%以上的细胞出现细胞脱落等病变效应时，收取病毒液，保存于-80℃冰箱中。

取-80℃冻存的EC30病毒液400 mL，反复冻融3次后。4℃4 000 rpm离心30 min，收集上清。依次加入50%PEG8000溶液至终浓度为10%、4 M NaCl至终浓度为200 mM、10%TritonX-100溶液至终浓度为1%。4℃搅拌过夜后，12 000 rpm 4℃离心1 h，用pH 7.4，10 mM Tris溶液重悬沉淀。同时配置10%～50%（W/V）的蔗糖（10mMtris溶液，pH 7.4）密度梯度，将重悬液体置于梯度上，Beckman SW28转子27 000 rpm 4℃离心3 h，无刹车停止后，从上而下分层收集样品，并进行还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测。选取含有病毒颗粒的蔗糖溶液组分，使用蛋白质超滤管进行浓缩，期间添加10 mM Tris（pH 7.4）缓冲液置换溶液。

1.2.2 病毒颗粒的浓度定量及形态学检测 取上述病毒颗粒浓缩样品，使用DC Protein Assay Kit进行蛋白质定量分析，浓度测定后，取少量样品配制为浓度为0.5 mg/mL的溶液，将5 μL该溶液滴于铜网（74 μm镀碳支持膜）上，1分钟后使用滤纸吸去支持膜上残余液体，使用5 μL醋酸双氧铀染色液对支持膜进行染色，染色时间为1 min，吸干残余染液，红外烘烤灯烘干铜网后，使用Tecnai F20场发射低温冷冻透射电镜对样品进行电镜观察以确定病毒颗粒的纯度，并拍摄照片。

1.2.3 晶体条件筛选 取浓缩后并测定浓度为2.5 mg/mL的病毒颗粒溶液,使用hampton晶体试剂盒进行结晶条件筛选，获得EC30病毒的晶体。

2 结果

2.1 病毒颗粒的纯化

RD细胞接种EC30病毒后扩增培养，收集细胞培养液经过滤去除杂质后使用蔗糖梯度离心法分离各组分，按不同密度梯度收集各组分样品，处理后经SDSPAGE胶电泳考马斯亮蓝染色结果如图所示 （图1）：BSA血清在较低浓度的蔗糖梯度中分布（1～14），空病毒壳由 VP0（36 kDa），VP1(32 kDa)和 VP3(26 kDa)组成（15～21），而成熟的病毒颗粒包括 VP1(32 kDa)，VP2(28 kDa)，VP3(26 kDa)和 VP4(8 kDa)（22～27）。 VP4 由于分子量小（8 kDa），在蛋白胶分离范围外，因此成熟病毒颗粒仅见VP1、VP2、VP3这3个蛋白条带。

图1 SDS-PAGE电泳检测蔗糖梯度分离EC30病毒。目的产物成熟病毒颗粒集中在22-27号管中

2.2 病毒颗粒形态观察

选取收集含有成熟病毒颗粒的组分，使用蛋白质超滤管进行浓缩，期间添加10 mM Tris（pH 7.4）缓冲液置换溶液。最终获得病毒颗粒蛋白浓度2.5 mg/mL。SDS-PAGE胶电泳考马斯亮蓝染色结果如图所示 （图2A），可见高纯度病毒颗粒（virion）条带，分子量与预期结果一致。目的产物用透射电镜观察（图2B），发现大部分产物以30 nm左右直径的球形颗粒的形式存在；未正确包装的病毒颗粒所占比例极少，暗示该方法获得病毒颗粒质量高且颗粒大小均一。

图2 EC30成熟病毒颗粒纯化的负染色电镜结果

2.3 EC30结晶条件筛选

获得高纯度的埃可30型病毒后，使用Hampton试剂盒筛选优化晶体生长条件。经对比研究后发现病毒蛋白在浓度为 2.5 mg/mL，0.2 M Sodium chloride，0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6，30%v/v (+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol的结晶条件下，得到如图3所示高质量晶体。

图3 EC30成熟病毒颗粒的晶体

3 讨论

近年来，由埃可病毒感染引起的幼儿无菌性脑膜炎流行呈现散发趋势。针对埃可病毒6，9等致病性较强亚型的减活疫苗目前已进入研制中，但是针对埃可病毒30亚型尚缺乏相应的对症治疗方案。日前对EC30流行性病学研究较多，但是结构方面报道甚少，制约其疫苗和药物的开发。因此，建立快速高效的EC30病毒颗粒蛋白生产纯化系统对于疫苗学研究及病毒结构功能学研究均具有重大的意义。

该研究主要借鉴同属肠道病毒科的人肠道病毒71型（EV71）病毒培养纯化经验，使用RD细胞作为EC30病毒的生产细胞，并结合使用蔗糖密度梯度离心法收集纯化病毒颗粒并获得成功。RD细胞是最为广泛使用的病毒生产细胞之一，遗传背景及生物学性质明确，应用于人疫苗生产安全性较高。同时使用蔗糖密度梯度离心法回收病毒颗粒，相比与氯化铯法，成本低廉且操作简便，尤其适用于工业化大生产。同时，相较于传统的分布盐析法或其它蛋白沉淀法，使用蔗糖密度梯度法可以更好的保存病毒颗粒的完整型。通过透射电镜成像检测可见，绝大部分病毒颗粒结构完整均一，且非病毒颗粒结构杂质含量较少，显示该方法不仅操作简便，回收率高，而且可以更好的保持病毒颗粒潜在的生物学功能，在生产工艺上具有明显优势。

该研究还基于纯化病毒颗粒，使用Hampton晶体生长筛选系统，比较了不同蛋白浓度，不同缓冲液成分，盐粒子浓度及温度等环境因素对于EC30病毒颗粒蛋白形成蛋白晶体的影响，并最终确认EC30病毒颗粒可在病毒蛋白浓度为2.5 mg/mL，0.2 M Sodium chloride，0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6，30%v/v(+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol的结晶条件下形成蛋白晶体。已有文献报道埃可7、11、12型病毒及病毒受体复合物的晶体结构[8]，通过对EC30病毒蛋白晶体的分析研究，并综合其它已有的埃可病毒晶体结构,可以明确地了解病毒颗粒装配过程并发现潜在的干预机制，有助于进一步认识埃可病毒的感染机制及致病过程。

综上所述，使用蔗糖密度梯度离心法能高效的分离纯化EC30病毒，其蛋白晶体的获得，再一次验证了该方法获得的病毒蛋白的纯度及质量。该研究为后续EC30病毒结构功能学研究建立了良好的基础，综合分析已有的其他肠道病毒晶体结构，为抗病毒性脑膜炎的药物设计以及肠道病毒的疫苗研制提供科学依据。