曹丹 任艳 罗晓光 魏玲

帕金森病(parkinson disease, PD)是一种中老年常见的中枢神经系统慢性炎症性疾病, 小胶质细胞(Microglia, MI)介导的神经免疫炎症反应在PD发病过程中发挥着关键的作用［1］。MI是中枢神经系统固有的巨噬细胞及免疫细胞, 在脑部炎症、脑缺血、阿尔茨海默病、PD等多种中枢神经系统病变中发挥着修复和损伤的双重作用。有研究证实MI老化后其功能由神经保护向神经损伤转变。因此, 本实验拟建立老化MI与受损的PC12神经元共育的微环境模拟PD细胞模型来观察老化MI对多巴胺(dopamine, DA)能神经元生存的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 MI培养 MI细胞为原代大鼠的神经MI, 购于PriCells生物医药科技有限公司。取对数生长期细胞用于实验, 以4×105/孔种植于筛板中 , 以终浓度 100 ng/ml 佛波酯 (PMA)刺激MI细胞72 h后换掉含有PMA的培养液, 并磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗3遍作为共育时所需老化MI。

1.2 PC12传代培养 复苏后的PC12细胞(购于中国科学院细胞研究所)种于RPMI1640培养液中培养(购于Hyclone公司, 美国), 于 37℃、5%CO2培养箱中孵育。PC12细胞呈半悬浮状态生长, 传代7～8次后转为贴壁生长。取对数生长期细胞用于实验。

1.3 损伤PC12制备 以低剂量250 nM鱼藤酮(购于Sigma,美国)刺激PC12细胞8 h后, 收集损伤PC12细胞于24孔板上。

1.4 实验分组 将过度活化后的MI及转移筛网移入生长有受损的PC12细胞内的培养板内, 实验分为三组：①空白对照组: 培养的PC12细胞, 未给予任何处理药物；②PC12+老化MI组：PC12与老化MI共育；③鱼藤酮PC12+老化MI组：鱼藤酮损伤PC12后与老化MI共育。以孔板培养皿和相应尺寸的转移筛网建立两种细胞的共育系统, 转移筛网孔径8 μm,能够允许转移筛网内外的大分子蛋白和液体交流, 但不允许细胞通过。共育24 h结束后移走转移筛板及其上面的细胞,对收集PC12细胞进行PC12细胞凋亡检测。

1.5 MI老化相关β-半乳糖苷酶(β-gal)染色 每孔加入300 μlβ-gal染色固定液 , 室温固定 15 min；吸除细胞固定液 ,用PBS洗涤细胞3次；每孔加入300 μl染色工作液(试剂盒购于上海碧云天)；37℃无CO2温箱孵育过夜；普通光学显微镜下观察。

1.6 PC12细胞凋亡检测 按照凋亡试剂盒说明(购于上海碧云天), 以磷脂结合蛋白(Annexin V-FITC)一碘化吡啶(PI)双染进行细胞早期凋亡检测。消化收集PC12细胞, 用冷PBS 充分洗涤细胞 2 次 , 250 μl结合缓冲液重新悬浮细胞 , 取195 μl的细胞悬液加入 5 μl Annexin V-FITC, 轻轻混匀后间隔3 min, 再加入 10 μl浓度为 20 ng/ml的 PI溶液 , 混匀后于室温避光孵育 10 min, 加 300 μl结合缓冲液 , 轻轻混匀 , 流式细胞仪检测, 每组均设3例样本。

1.7 统计学方法 采用SPSS23.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差( -±s)表示, 采用 t检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 老化MI形态鉴定 β-gal是一种鉴别细胞衰老的生物学标志。在pH=6.0, 随着细胞老化, 胞内产生的蓝色沉淀物也越多, 即染色阳性, 表明细胞进入衰老状态。但对静止期细胞、永生化细胞和肿瘤细胞中的β-gal活性不显色。β-gal染色结果显示, PMA刺激MI组蓝染阳性细胞数明显增加。

2.2 PC12细胞生长形态学变化 空白对照组为分化期PC12细胞, 胞体呈梭形或者三角形贴壁生长；PC12+老化MI组和鱼藤酮PC12+老化MI组细胞形态变得不规则, 突起结构逐渐消失或者变短, 细胞体积逐渐变小, 变圆。

2.3 PC12细胞凋亡率测定 PC12+老化MI组和鱼藤酮PC12+老化MI组的细胞凋亡率均显著高于空白对照组, 差异具有统计学意义(P＜0.05), 且鱼藤酮PC12+老化MI组的细胞凋亡率最高。见表1。

表1 三组干预后PC12细胞凋亡率比较(±s,%)

表1 三组干预后PC12细胞凋亡率比较(±s,%)

注 ：与空白对照组比较 , aP＜0.05

组别 例数 细胞凋亡率空白对照组 3 17.51±1.11 PC12+老化MI组 3 41.37±0.69a鱼藤酮PC12+老化MI组 3 42.54±0.83a

3 讨论

PD是一种中老年常见的中枢神经系统退行性病变, 其主要病理标志是路易小体形成和黑质区DA能神经元的死亡。其发病率随年龄增长而显著增加, 65岁以上人群发病率达1.7%, 80岁以上可达10%, 85岁以上的老人接近50%有轻度帕金森样症状［2］。MI是中枢神经系统中最有代表性的免疫细胞, 发挥监测脑内异常变化的功能。MI对外界环境刺激非常敏感, 既可以通过吞噬组织中的病原体及有害颗粒对神经元起到保护作用, 也可以通过分泌炎性细胞因子对神经元起毒性作用。有研究证实MI老化后其功能由神经保护向神经损伤转变。近年来, 众多研究报道MI激活参与中枢黑质纹状体炎症过程, 从而加重PD的DA能神经元的变性凋亡过程［3］。动物实验证实：低剂量鱼藤酮对青年鼠的DA神经元没有影响, 而在老年鼠则有 20%～30%的DA神经元死亡［4］,可见老化提高了DA神经元对神经毒素的敏感性。本研究推测老化MI可分泌各种炎性介质, 持续对周围微环境施加影响。当脑内老化MI大量存在时, 脑内微环境发生改变, 遭遇病理刺激后发生过度炎症反应, 引发氧化应激产物的大量释放, 促进了DA神经元的死亡。

老化MI不仅释放的炎症介质显著增多, 其对损伤的反应也发生显著改变。这些老化MI并不会迅速死亡而是长期存在于脑内, 通过释放炎性介质等持续对DA神经元生存的微环境施加负面影响, 最终导致DA神经元的大量死亡。PC12细胞因其在形态、生理、生化等功能特别是合成和储存DA和去甲肾上腺素递质上与中脑DA 能神经元功能十分接近而已成为体外替代DA 能神经元常见的细胞模型。本实验中老化MI与损伤的PC12共培养体系模拟体内MI和DA能神经元的相互作用, 共培养后, 结果发现老化的MI显著降低了正常PC12和受损PC12的存活率。提示在本实验环境下,老化的MI不利于损伤神经细胞的恢复, 具有神经毒性作用。大量实验发现过度激活的MI可以通过释放大量毒性兴奋性氨基酸等介导神经元损伤。

综上所述, 本研究体外模拟MI与黑质DA能神经元间相互作用, 结果证实老化的MI明显提高了DA能神经元的生存率, 其可能是通过持续的MI炎症反应而发挥神经毒性作用导致神经病理改变。