韩利东， 郑 重， 王申元， 苏广华， 高广琦， 武云喜， 张晓然， 乌日汉， 李光鹏， 张 立*

(1.内蒙古大学省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，呼和浩特 010070；2.内蒙古农业大学，呼和浩特 010018；3.内蒙古内大圣牧高科牧业有限公司，呼和浩特 011500)

日本和牛(Japanese black cattle)是日本当地黄牛与海福特、安格斯等肉牛杂交培育的世界著名肉牛品种之一，其肌间脂肪丰富，肉中富含不饱和脂肪酸，质地柔软，鲜嫩可口，肉质呈明显的大理石花纹，在国际高档牛肉市场上饱受青睐[1-3]。近年来，我国肉牛养殖业发展迅速，传统的养殖模式面临着结构转型，选择优良的肉牛品种及多元化的养殖模式使得中高档肉牛的养殖在中国蓬勃发展[4-5]。为了满足国内市场消费的需求，很多企业从新西兰、澳大利亚等国引进和牛、安格斯等优质肉牛品种。但是，活体引种成本高、常规繁育速度慢等一些问题严重影响了国内中高档肉牛养殖产业的发展。为了促进国内良种肉牛的发展，2009年，内蒙古大学通过体细胞克隆技术，成功培育出国内首批体细胞克隆和牛。目前，已经培育成国内最大群体的纯种和牛群,使得群体在短期内快速扩繁的最有效的技术手段无疑是超数排卵(multiple ovulation)和胚胎移植(MOET)技术。目前，国内外对影响牛的超数排卵效果的研究有很多，例如供体牛品种的选择,供体牛的饲养管理水平,供体牛的月龄、外源激素种类、激素剂量、季节等[6-8]，但对和牛超数排卵的研究较少[9-10]，并且对体细胞克隆和牛的超数排卵的研究还没有报道，鉴于此，本试验研究了不同剂量FSH和不同季节对体细胞克隆和牛超数排卵效果的影响，以期摸索出一套成熟、稳定的体细胞克隆和牛胚胎生产方案，为建立完善的体细胞克隆牛繁育体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验设计

分别使用总剂量为320 mg、360 mg及400 mg的加拿大进口FSH，在春、夏、秋、冬季节利用CIDR+FSH+PG对体细胞克隆和牛进行超数排卵，探讨体细胞克隆和牛超数排卵过程中的最佳FSH剂量，以及季节对体细胞克隆和牛超数排卵效果的影响。试验于2017年1—12月在内蒙古内大圣牧高科牧业有限公司完成，具体方案见表1。

表1 试验方案

1.2 试验材料

1.2.1 试验动物及精液的选择 选取内蒙古大学通过体细胞克隆技术生产的系谱完整、无生殖道疾病、营养状况良好，有正常发情周期的36～48月龄的体细胞克隆和牛及后代(见图1)。细管冻精选自内蒙古大学生产的体细胞克隆和牛种公牛(见图2)的冻精。

图1 体细胞克隆和牛供体

图2 体细胞克隆和牛种公牛

1.2.2 供体体细胞克隆和牛的饲养管理 在超数排卵过程中饲养管理水平和营养水平是决定胚胎质量的关键因素，超数排卵前应对供体克隆和牛加强饲养管理，以提高克隆和牛的超排效果及胚胎质量。从前期处理即放入CIDR前45～60 d，开始加强饲养管理，单独组群并编号，每头牛每天饲喂全价饲料3～4 kg，同时肌肉注射VA、VD和VE。

1.2.3 试验药品 新西兰进口孕酮类制品：EAZI-BREED CIDR(controlled internal release device)1.9 g Progesterone/支；垂体促卵泡素(FSH),加拿大进口，400 mg/瓶(20 mL稀释)；氯前列烯醇(PG)由上海计划生育研究所生产，0.2 mg/支；2%的盐酸利多卡因；杜氏磷酸缓冲液(PBS)，新西兰生产，每份9.6 g；1.5 mol/L乙二醇冷冻液(含0.1 mol/L蔗糖)，美国生产，20 mL/瓶；保存液(Holding)，美国生产，50 mL/瓶。

1.3 试验方法

1.3.1 超数排卵方法 将自然发情之日或放CIDR之日定为发情第0天，在第9天开始超数排卵，采用连续4 d注射FSH进行超排处理，并在注射FSH的第3天(第5针)同时注射PG，打完最后一针取CIDR，第13天观察发情，进行人工授精。具体程序见图3。

图3 供体体细胞克隆和牛超排FSH递减法注射程序

1.3.2 胚胎采集 在超数排卵发情后的第7天采取二路冲卵管法进行非手术冲胚。首先将牛保定以免操作人员受伤，用5 mL注射器抽取5 mL、2%的盐酸利多卡因进行尾椎硬膜外麻醉。然后使用子宫颈粘液去除器吸除粘液。用直肠把握法将带有钢芯的冲卵管从阴门送到子宫角。当冲卵管前端送达子宫角前端时，用20 mL注射器给冲卵管气囊充气约9～13 mL，气囊充好气后抽出冲卵管钢芯；用50 mL注射器每次吸取20～45 mL冲卵液从输入管注入子宫角，然后吸回，反复3～4次，每个子宫角用150～220 mL冲卵液，将回收液带到实验室内放到集卵杯过滤,把过滤好的回收液在室温下(18～22 ℃)静置5～8 min，镜检。

1.3.3 胚胎级别鉴定 根据胚胎的形态、发育的状态等将胚胎分为4级。A级：形态规则，卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质致密，透明带完整，色泽和分布均匀一致。B级：与A级胚胎相比细胞大小略微不均匀，但卵细胞和分裂球的轮廓清晰，细胞质较致密，水泡样和变性细胞不超过10%～20%。C级：形态变化明显，卵细胞和分裂球的轮廓稍不清晰，细胞质不均匀，色泽发暗，水泡样和变性细胞占30%～50%。D级：胚胎变性、退化。

1.3.4 胚胎冷冻 将检出的A、B级胚胎用保存液洗4～6次→1.5 mol/L乙二醇/保存液→平衡15～20 min装管→冷冻仪(-5.5～-7.0 ℃)平衡5 min后植冰，继续平衡5 min(温度以0.3～0.6 ℃/min的速率下降),当温度降到(-32)～(-35) ℃平衡5 min→投入液氮。

1.4 数据处理

用Graph Pad Prism数据处理软件对相关数据进行差异显著性分析，结果均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 超排后发情效果分析

试验使用比较成熟的超数排卵方法——CIDR+FSH+PG法，结果表明，试验中的体细胞克隆和牛在撤出CIDR后的24 h内发情率有所差异，但在36 h内发情率均为100%，见表2。

表2 体细胞克隆和牛同期发情效果结果

2.2 体细胞克隆和牛超数排卵FSH最适剂量选择试验

表3结果显示，使用FSH剂量为360 mg组获得的胚胎总数和头均胚胎总数显著高于320 mg组(P<0.05)，但是低于400 mg组，差异不显著(P>0.05)。360 mg组获得的头均可用胚胎数和胚胎可利用率均高于320 mg组和400 mg组，差异显著(P<0.05)。由此，对36～48月龄的体细胞克隆和牛使用360 mg的FSH进行超数排卵试验最适。

表3 体细胞克隆和牛超数排卵结果

注:同列数值之间标有相同字母上标表示差异不显著(P>0.05)，标有不同字母上标表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.3 不同季节对体细胞克隆和牛超数排卵效果的影响

由表4结果可知，在内蒙古呼和浩特地区季节对体细胞克隆和牛超数排卵效果有一定的影响，在秋季超排获得的胚胎总数、头均胚胎总数、头均可用胚胎数及胚胎可用率均高于春季、夏季和冬季，且夏季超排效果最差，差异均不显著(P>0.05)。

表4 不同季节使用360 mg的FSH超排结果

3 讨 论

供体牛在进行超数排卵时，使用FSH激素的剂量会受到母畜的年龄、体重、胎次、营养水平等因素的影响[11-12]，如果考虑不周将会影响母畜的超数排卵效果。在超数排卵过程中，如果超排剂量偏低可能会造成卵巢不启动，不排卵，无法获得胚胎；如果超排剂量偏高，可能会导致母畜的卵巢过度增大，未受精卵和不排卵的卵泡增多等结果[13-14]。试验结果2.2表明，使用较大剂量的FSH时，获得的胚胎总数和头均胚胎数较多，但是胚胎可利用率明显低于剂量较小的两组。所以笔者认为，超数排卵过程中最好选择最适的FSH激素剂量，从而避免大剂量激素对母畜卵巢的损害，同时还能提高可用胚胎的利用率。

目前，关于季节对牛超数排卵效果影响的结论并不一致。Massey等的研究结果表明，季节对牛超数排卵效果无明显的影响[6]；和占星等和Barati等的研究表明，季节对可用胚胎数的影响不显著[15-16]。然而另一些研究者则认为季节对牛的超排效果有显著的影响，Lerner等研究结果表明，在春季对荷斯坦牛超排获得的可用胚胎数极显著高于其他季节[17]；徐照学等研究结果表明，秋季和冬季对牛超数排卵的效果优于春季[18]；陈龙等和李强等的研究均表明，在夏季超排获得的可用胚胎数显著低于其他季节[19-20]。不同的试验地点、饲养环境、超数排卵方案及供体牛的品种等因素可能导致上述结论的不一致性。本研究结果发现，在秋季对体细胞克隆和牛超数排卵获得的胚胎总数、头均胚胎总数、头均可用胚胎数及胚胎可用率均高于春季、夏季和冬季，它们之间差异均不显著(P>0.05)。在内蒙古呼和浩特地区的夏季(7月)，对体细胞克隆和牛超数排卵的效果是最差的，导致这样结果的原因可能是炎热季节引起的热应激。热应激能够引起母牛子宫血流量降低和子宫内温度增加，从而影响胚胎附植前的发育和超数排卵效果[21-22]。因此，为减少热应激对体细胞克隆和牛超数排卵效果的影响，可在炎热的夏季暂停或减少超数排卵工作，从而提高体细胞克隆和牛超数排卵的效率。

刘潇等对纯种育成和牛进行超排，获得了头均可用胚胎数达6.5枚以上的结果[3]。孙凤俊等对成年日本和牛超排试验，获得了头均可用胚胎数达6枚以上的结果[23]。郝海生等对青年日本和牛进行超排试验，获得了头均可用胚胎数达6.23枚以上的结果[13]。本试验结果表明，使用常规的超数排卵方法对体细胞克隆和牛进行超数排卵，在不同的季节均得到了良好的超排效果，说明体细胞克隆和牛在生产胚胎性能方面与常规和牛没有区别。1938年，德国的科学家Spemman提出了细胞核移植的概念[24]，随后小鼠成为了通过核移植技术获得的首例哺乳动物[25]。1997年，随着克隆羊Dolly的诞生[26]，促使体细胞克隆技术迅速的发展，打开了克隆动物研究的新局面。目前，体细胞克隆技术在畜牧业生产中得到了广泛的应用，但是体细胞克隆动物各方面的生产性能还需要进一步研究。通过本试验获得的体细胞克隆和牛的胚胎，笔者分别进行了鲜胚与冻胚的移植试验，并且获得了较好的妊娠率(待发表资料)。