延 芳

(石河子大学医学院第一附属医院临床营养科，新疆 石河子 8320002)

不同营养状态老年胃癌患者的二肽转运载体1蛋白表达及调控机制

延 芳

(石河子大学医学院第一附属医院临床营养科，新疆 石河子 8320002)

目的探讨不同营养状态老年胃癌患者的二肽转运载体(PEPT)1蛋白表达及调控机制。方法胃癌患者42例，根据营养风险筛查2002评分结果分为无营养风险组(评分<3分)31例，有营养风险组(评分≥3分)11例。术中取小肠黏膜标本，Western印迹法检测PEPT1蛋白表达水平；酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子(TNF)-α浓度。取人结肠腺癌SW1116细胞，分别用不同浓度(20、50、100 μg/L )的TNF-α干预，于不同时间点(24 h、48 h、72 h)检测SW1116细胞中蛋白表达水平。结果患者Lauren分型、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期与小肠组织中PEPT1蛋白表达的关系均无统计学意义(P>0.05)；有营养风险组患者的小肠组织中PEPT1蛋白表达水平明显高于无营养风险组(P<0.01)。有营养风险组患者血清TNF-α浓度明显高于无营养风险组(P<0.05)；胃癌患者小肠组织中PEPT1蛋白表达水平与血清TNF-α浓度呈正相关(r=0.851,P<0.05)。20、50、100 μg/L TNF-α处理24 h的SW1116细胞PEPT1蛋白表达水平均明显高于空白对照组(P<0.05)；50 μg/L TNF-α分别处理24 h、48 h、72 h的SW1116细胞PEPT1蛋白相对表达量均明显高于空白对照组(P<0.05)。结论有营养风险的老年胃癌患者小肠PEPT1蛋白表达上调，其机制与TNF-α调控作用有关。

二肽转运载体；胃癌；营养风险筛查2002；肿瘤坏死因子

胃癌患者长期进食困难，根治术前多数存在不同程度的营养不良，因手术创伤大，术后较长时间的禁食和应激状态，机体代谢率增加的同时无法获得足够的营养，导致患者营养状况进一步恶化〔1〕。营养不良不仅损害胃癌患者组织脏器功能，还会降低免疫力，延长手术伤口愈合时间，增加感染率，影响治疗预后〔2〕。相关研究显示，蛋白质消化产物主要以二肽形式被吸收，其转运和摄取功能主要依赖肠道上皮细胞中的二肽转运载体(PEPT)1〔3〕。本研究拟探讨患者不同营养状态与小肠组织中PEPT1蛋白表达的关系，并通过体外细胞实验进一步分析相关细胞因子的调控机制。

1 材料与方法

1.1病例与标本 选取2016年1～10月石河子大学医学院第一附属医院普外科收治的胃癌患者42例。筛选标准：①年龄≥60岁，病理确诊为胃癌，签署知情同意书；②术前未接受放化疗和营养支持；③无明显消化道出血，心肺功能障碍。根据欧洲肠外肠内营养学会(ESPEN)推荐的营养风险筛查2002评估表将入选患者分为无营养风险组(评分<3分)31例，有营养风险组(评分≥3分)11例。术前采集患者肘静脉血，室温下凝血40 min，2 000 r/min离心20 min，分离上层血清。术中切除上段小肠黏膜组织，-80℃保存待测。

1.2主要试剂 人结肠腺癌SW1116细胞购于上海拜力生物科技有限公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(上海索宝生物科技有限公司)；山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(上海倍卓生物科技有限公司)；羊抗人PEPT1一抗，兔抗羊PEPT1二抗(深圳市豪地华拓生物科技有限公司)；人肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒(上海广锐生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1小肠黏膜组织中PEPT1蛋白表达检测 取200 mg组织标本放入2 ml EP管中，加RIPA蛋白裂解液200 μl，4℃恒温10 000 r/min离心20 min，收集上清蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。常规行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，湿法转移至聚偏二氟乙烯滤膜。Tris盐酸缓冲液(TBST)封闭液冲洗后滴加羊抗人PEPT1一抗(1∶1 000稀释)，兔抗羊PEPT1二抗(1∶500稀释)，洗涤后曝光，Image J软件分析目标条带吸光度值。

1.3.2血清TNF-α浓度检测 将试剂盒稳定平衡至室温，按说明配置工作液、标准品。将稀释后的不同浓度标准品和标本加入96孔板中，设置空白对照孔，37℃ 静置60 min，弃去液体，磷酸缓冲液冲洗，滴加生物素标记的抗体，37℃ 静置60 min，冲洗后滴加稀释的酶结合物工作液，37℃ 静置20 min。加显色剂暗室反应20 min，终止反应，检测450 nm处吸光度值。

1.3.3SW1116细胞PEPT1蛋白表达检测 常规复苏SW1116细胞，间隔72 h后分装4个培养瓶进行传代培养，分别滴加20、50、100 μg/L TNF-α，并设置空白对照，混合均匀后孵育24 h。再次复苏SW1116细胞，50 μg/L TNF-α分别处理24 h、48 h、72 h，并设置空白对照。将上述细胞培养液10 000 r/min离心10 min，Western印迹法检测SW1116细胞不同时间和不同浓度TNF-α处理后PEPT1蛋白表达水平。

1.4统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验、F检验；相关性进行Pearson分析。

2 结 果

2.1患者临床指标与小肠组织中PEPT1蛋白表达的关系 胃癌患者Lauren分型、肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期与小肠组织中PEPT1蛋白表达的关系均无统计学意义(P>0.05)；有营养风险组小肠组织中PEPT1蛋白表达水平明显高于无营养风险组(P<0.01)。见表1，图1。

2.2患者血清TNF-α浓度与PEPT1蛋白表达的关系 有营养风险组血清TNF-α浓度均值〔(0.24±0.09)μg/L〕，明显高于无营养风险组〔(0.18±0.05)μg/L，P<0.05〕。胃癌患者小肠组织中PEPT1蛋白表达水平与血清TNF-α浓度呈正相关(r=0.851，P<0.05)。

表1 胃癌患者临床指标与PEPT1蛋白表达的关系

1、2：有营养风险组；3、4：无营养风险组图1 小肠组织中PEPT1蛋白表达情况

2.3TNF-α处理的SW1116细胞中PEPT1蛋白表达 20、50、100 μg/L TNF-α处理24 h的SW1116细胞PEPT1蛋白相对表达量分别为0.69±0.17、0.75±0.20、0.86±0.24，均明显高于空白对照组的0.57±0.13(P<0.05)，见图2。

1：空白对照组；2：20 μg/L TNF-α；3：50 μg/L TNF-α；4：100 μg/L TNF-α图2 不同浓度TNF-α作用后的SW1116细胞 PEPT1蛋白表达情况

50 μg/L TNF-α分别处理24、48、72 h的SW1116细胞PEPT1蛋白相对表达量分别为0.51±0.13、0.72±0.25、0.91±0.32，均明显高于空白对照组的0.43±0.08(P<0.05)。见图3。

1：空白对照组，2：作用24 h，3：作用48 h，4：作用72 h图3 50 μg/L TNF-α不同作用时间后的SW1116 细胞PEPT1蛋白表达情况

3 讨 论

PEPT1为依质子的寡肽转运体超家族成员，编码hPEPT1的cDNA和氨基酸蛋白，相对分子量约为78 000 kD。PEPT1为氢离子依赖性具有低亲和力和高容量的寡肽转运体，多表达于小肠黏膜上皮细胞，为二肽等蛋白质产物吸收的主要环节〔4〕，病原菌、胰岛素、miRNA等多种因素均可影响其表达水平〔5〕。本次研究提示PEPT1蛋白表达水平与老年胃癌患者营养状况相关。短肠综合征等肠道慢性病老年患者中均存在结肠PEPT1蛋白表达水平上调，同时合并TNF-α、TNF-γ等促炎性细胞因子表达水平增加〔6〕。在炎性肠道疾病患者中，TNF-α、TNF-γ炎性因子的表达水平也增加，且相关研究显示，TNF-γ可有效提升人小肠组织中PEPT1蛋白表达水平和运输能力〔7〕。体外细胞学研究显示，TNF-α干预人结肠腺癌SW1116细胞可明显提升细胞中PEPT1蛋白表达水平。胃癌患者中能否通过TNF-α干预PEPT1蛋白表达，进而改善营养状况，仍需要进一步证实。

本次研究发现，有营养风险的老年胃癌患者小肠组织中PEPT1蛋白表达上调；可在术前对该类患者进行营养风险筛查评分，对有营养风险的老年患者有针对性地设计肠外或肠内营养支持。

1王佳铭，曹春远，马 震，等.老年胃癌患者20例围术期肠内营养支持〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(19)：4278-9.

2杨丛莲.奥沙利铂黄芩素联合应用对胃癌细胞抑制作用的影响研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2016；17(5)：640-3.

3刘 羽.应用蛋白质组学技术鉴定胃癌分化相关蛋白及Serpin B1表达与机制的研究〔D〕.石家庄：河北医科大学，2012.

4钟武装，肖丽萍，蔡敏捷，等.早期肠内营养对老年胃癌患者术后免疫功能的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(2)：280-2.

5王 颖.长链非编码RNA DMTF1v4(NR_024549)在胃癌多药耐药中的作用及机制研究〔D〕.西安：第四军医大学，2012.

6杨励励.2010-2013年锦州市居民恶性肿瘤死亡原因分析〔J〕.中国卫生工程学，2016；15(1)：75-6.

7梁 好.胃癌、食管癌的病因学研究和环境危险因素人群归因危险度的评价〔D〕.北京：协和医学院，2012.

〔2017-06-16修回〕

(编辑 袁左鸣)

R73

A

1005-9202(2017)18-4572-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.064

延 芳(1980-)，女，硕士，主治医师，主要从事临床营养研究。