狄婷婷 张 美 王瑞婷

(承德医学院，河北 承德 067000)

不同浓度β-淀粉样蛋白对大鼠小胶质细胞特异性蛋白CD11b表达的影响

狄婷婷1张 美 王瑞婷

(承德医学院，河北 承德 067000)

目的探讨免疫细胞膜表面整合素 (CD11b)在β-淀粉样蛋白(Aβ)所引起阿尔茨海默病(AD)中的作用、机制及与Aβ剂量的关系。方法雄性Wistar大鼠50只，随机分为A、B、C、D、E 5组，每组10只；A组大鼠双侧海马CA1区注射5 μl生理盐水，B～E组双侧海马注射5 μl Aβ (分别含Aβ25～350.5、1、5、10 μg)；HE染色观察五组大鼠海马CA1区细胞形态及数量变化；免疫组化(IHC)检测海马CA1区Aβ、CD11b表达；实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测CD11b mRNA表达。结果HE染色，光镜下观察D组、E组大鼠海马CA1区神经细胞数明显少于A组、B组、C组(P<0.01)；IHC检测D组、E组两组Aβ阳性表达率均高于A组、B组、C组(P<0.01)；D组、E组CD11b阳性表达率明显高于A组、B组、C组(P<0.01)；qRT-PCR检测大鼠海马组织内CD11b mRNA表达D组、E组组明显高于A组、B组、C组(P<0.01)。结论Aβ可激活小胶质细胞，募集MG到Aβ沉积部位，Aβ沉积量和CD11b表达量呈正相关。

阿尔茨海默病；淀粉样蛋白；小胶质细胞；免疫细胞膜表面整合素

阿尔茨海默病(AD)是一种以认知功能障碍及记忆减退或缺失为主要特征的中枢神经退行性疾病〔1〕，其病理改变以大脑皮层和海马区的神经细胞外老年斑(SP)〔2〕形成、神经细胞内出现神经纤维缠结(NFTs)〔3〕、神经突触的丢失和神经元细胞凋亡为主要特征〔4，5〕。其中，SP是AD最具特征性的病理改变，主要由β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积而成〔6，7〕，在SP周围有大量活化的小胶质细胞(MG)和炎性因子存在〔8，9〕。有研究认为，MG是AD脑内炎性反应中最重要的炎性细胞，介导AD病理发展的全过程。免疫细胞膜表面整合素(CD11b)为MG的特异性表面标志物，其主要在活化的MG胞质中表达，MG在AD发生过程中起“双刃剑”的作用，即Aβ激活MG，活化的MG清除、吞噬Aβ，起保护作用〔10〕。MG的“双刃剑”作用有无转折点，CD11b的表达是否与Aβ剂量有关，成为AD炎症机制的研究热点。

1 材料与方法

1.1实验动物、仪器及主要试剂 Wistar大鼠50只，成年雄性，年龄10～12 w，体重(250±20)g，SPF级，动物证号No.11400700022071，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供〔许可证号：SCXK(京)2012-0001〕。江湾Ⅰ型C脑立体定位仪；微量进样器；Excelsior ES全自动组织脱水机；Z-BJ0010包埋聚合器；RM2125型石蜡切片机；CK40-F200相差倒置显微镜；Olympus显微镜摄像装置；MDF-192型超低温冰箱(-80℃)；DU80型紫外分光光度计；Mx3000P型实时荧光定量PCR仪；各种规格的微量移液器等。Aβ25～35(A4559，Lot：112M4775V)购自美国Sigma-Aldrich有限公司，HPLC检测纯度≥97%；通用型SP-9001免疫组化染色试剂盒(Lot：14188A)、辣根过氧化物酶、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒 (ZLI-9017，Lot：K136620C)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Aβ25～35抗体(Lot：980287W)购自北京博奥森生物技术有限公司；CD11b抗体(Lot：Y-07D10A)购自武汉博士德生物工程有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒(RR820A，Lot：AK4505)、RNAiso Plus(9108Q，Lot：AK7602)、DEPC水(9013A，Lot：AA1801A)、反转录试剂盒(RR047A，Lot：AK3701)，购自大连宝生物工程有限公司；其他试剂为分析纯。Aβ25～351 mg干粉溶于500 μl无菌生理盐水(2 g/L)，-20℃保存，临用前置于37℃孵育5～7 d成凝胶态。

1.2动物分组及处理方法 成年雄性Wistar 大鼠随机分为5组编号A、B、C、D、E，每组10只。大鼠麻醉后，将其固定在江湾Ⅰ型C脑立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱进行脑立体定位海马CA1区，A组大鼠双侧海马CA1区注射无菌生理盐水5 μl，B～E组分别注射不同浓度的Aβ25～35稀释液各5 μl(分别含Aβ25～350.5、1、5、10 μg)术后注射青霉素抗感染，于注射Aβ 14 d后处死，取脑组织标本。

1.3免疫组化(IHC)检测Aβ、CD11b表达 每组取4只大鼠脑组织制作标本后，每个标本选取海马CA1区细胞损伤段2张石蜡切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精水合，抗原修复，山羊血清封闭等步骤；滴加Aβ或CD11bⅠ抗(1∶80)，滴加Ⅱ抗，滴加ABC复合物，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替Ⅰ抗作为阴性对照。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，计算每组切片的光密度平均值，定量分析IHC检测Aβ、CD11b阳性细胞反应程度。

1.4qRT-PCR技术检测CD11b mRNA表达水平 每组取6只大鼠，麻醉后，迅速取新鲜脑海马组织暂存于超低温冰箱(-80℃)。采用Trizol法提取总RNA；紫外分光光度计检测RNA的纯度；根据RNA纯度检测结果计算应加入RNA样品的使用量，按反转录试剂盒说明书于冰上将总RNA逆转录合成CDNA；以β-actin为内参照，在GenBank数据库内查找CD11b的基因序列，由TaKaRa生物技术有限公司进行引物设计并合成，β-actin正义链5′-TGACAGGATGCAGAAGGAGA-3′，反义链5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′；CD11b正义链5′-ACCACTCATTGTGGGCAGCTC-3′，反义链5′-CACCGGCTTCATTCATCATGTC-3′。根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书，总反应体系为25 μl，反应条件：预变性95℃ 30 s，变性95℃ 5 s，退火51℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40个反应循环数，实时荧光定量PCR仪检测AD大鼠脑组织中CD11b mRNA表达水平，记录各组CT值，利用2-ΔΔCt的方法分析。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析及SNKq检验。

2 结 果

2.1各组大鼠海马CA1区神经组织形态结构 光镜下观察，A、B、C三组大鼠海马CA1区均可见3～4层细胞，核染色深，形态完整而清晰，有神经元的突起；而D、E组大鼠海马CA1区可见大段神经元缺失，细胞层数明显减少，多为1～2层，剩余的细胞肿胀，其细胞核染色浅，呈空泡状，突起消失，神经元缺失部分有大量胶质细胞浸润，以MG为主，并可见MG吞噬神经元现象，见图1。400倍视野下计数大鼠海马CA1区正常完整的神经细胞数，D组(84.75±8.10)、E组(66.63±15.18)大鼠海马CA1区神经细胞数明显少于A组(126.25±17.37)、B组(120.63±11.34)及C组(114.75±17.79)(均P<0.01)，且A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05)，D组明显高于E组(P<0.05)。

2.2IHC观察Aβ沉积部位及海马CA1区Aβ的表达 Aβ阳性表达为棕黄色颗粒物，分布在神经细胞外和MG胞质中，Aβ沉积部位主要在注射区(即海马CA1区)周围，见图2。IHC检测结果显示，D组(0.020 2±0.005 7)、E组(0.025 7±0.007 4)Aβ阳性表达率均明显高于A组(0.002 2±0.000 4)、B组(0.004 1±0.001 0)及C组(0.006 1±0.001 6)(均P<0.01)，且A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05)，D组明显低于E组(P<0.05)。

2.3IHC观察MG形态及CD11b表达 CD11b阳性表达为棕黄色颗粒物，包绕在神经元的周围，主要表达在活化的MG中，表达部位与Aβ沉积部位相似。A、B、C三组大鼠海马CA1区MG活化量少，且MG呈杆状，分枝也较少；D、E两组MG的胞体变大，呈椭圆，分枝增多，分布散落，见图3。IHC检测结果显示，CD11b阳性表达D组(0.046 0±0.008 3)、E组(0.061 5±0.007 8)明显高于A组(0.016 6±0.004 8)、B组(0.021 6±0.003 4)、C组(0.023 6±0.004 4)(均P<0.01)，且A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05)，D、E两组间差异显著(P<0.05)。

2.4qRT-PCR法检测大鼠海马组织CD11b mRNA表达 大鼠海马组织内CD11b mRNA表达水平D组(1.905 2±0.258 0)、E组(2.361 9±0.419 5)明显高于A组(1.000 0±0.000 0)、B组(1.180 3±0.060 6)及C组(1.279 5±0.182 1)(均P<0.01)，且A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05)，D、E两组间差异显著(P<0.01)。

图1 各组大鼠海马CA1区神经组织形态结构(HE，×400)

图2 各组大鼠海马CA1区Aβ表达(IHC，×400)

图3 各组大鼠海马CA1区CD11b表达(IHC，×400)

3 讨 论

AD是老年人常见的一种多因异质性疾病，其病理表现多样，涉及多种病理机制。Aβ作为AD发病的始动因子已得到公认〔11〕。体外凝聚状态的Aβ25～35与AD患者脑内的Aβ结构相似，有研究表明Aβ能引起神经元损伤〔12〕。本研究与汪保华等〔13〕研究结果相吻合，显示大鼠脑海马CA1区注射Aβ25～35可诱导海马神经元损伤，该方法可以用于AD模型制作〔14〕。

MG是中枢神经系统的免疫效应细胞，参与炎症和神经损伤，是神经退行性疾病的始动因子和促进因素〔15〕。MG处于静息状态时，缺乏吞噬功能，但具有吞饮和一定的迁移能力，可清除代谢产物，起到“清道夫”的作用。CD11b为MG的特异性表面标志物，其主要在活化的MG胞质中表达，本研究提示Aβ沉积可使MG活化，吞噬Aβ，与相关研究结果一致〔16～18〕，本研究显示Aβ剂量增长倍数为1∶2∶10∶20，而CD11b表达量为1∶1.08∶1.6∶2，即当Aβ剂量达到5 μg时活化的MG虽然明显增多，但不足以清除过多的Aβ，致使Aβ通过依赖和不依赖于MG途径引起D、E 两组神经元损伤。因此可以推测，当大鼠脑内注射凝胶态的Aβ后，MG被激活，当Aβ剂量较低时，MG对Aβ的吞噬和清除能力明显，可能还具有神经保护作用；但随着Aβ剂量不断增加，MG吞噬和清除Aβ的能力已经不足以清除脑内过多得Aβ，导致Aβ通过不依赖于MG途径引起神经元损伤。黄月等〔19〕采用不同剂量移植MG对AD大鼠脑内Aβ的作用发现Aβ有趋化MG的作用，但大剂量的MG在对Aβ吞噬作用的同时加速了Aβ的形成。可见，Aβ可激活MG，募集MG到Aβ沉积部位，Aβ沉积量和CD11b的表达量呈正相关。

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〔2016-09-09修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R363.2

A

1005-9202(2017)18-4446-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.007

河北省教育厅重点资助课题(No.ZD20131051)；河北省中医药抗痴呆重点研究室建设项目(No.20142803)；河北省高校重点学科资助项目(No.20130337)

1 承德护理职业学院

王瑞婷(1969-)，女，博士，教授，硕士生导师，主要从事阿尔茨海默病发病机制及中药抗痴呆作用研究。

狄婷婷(1981-)，女，硕士，副教授，主要从事阿尔茨海默病发病机制研究。