郑 杰 刘玉胜 张光昊 张行谦 高 敏 鹿庆华

(山东大学第二医院，山东 济南 250033)

阿格列汀对糖尿病大鼠肾脏病理改变的影响

郑 杰 刘玉胜 张光昊 张行谦 高 敏 鹿庆华

(山东大学第二医院，山东 济南 250033)

目的探讨糖尿病(DM)大鼠肾病中肾脏病理改变、细胞凋亡的机制及阿格列汀对细胞凋亡的影响。方法8周龄雄性Wistar大鼠50只，随机分为对照组(n=10)，DM组(n=20)，阿格列汀组(n=20)。各组正常饮食，腹腔注射小剂量链脲佐菌素构建糖尿病模型。模型稳定后，给予对照组、糖尿病组生理盐水灌胃，阿格列汀组以一定剂量阿格列汀研钵磨碎后生理盐水稀释灌胃。于21 w末监测血糖、血肌酐、尿素氮等生化指标，21 w末处死大鼠后苏木素-伊红(HE)染色、PAS染色、Masson染色等病理检测肾功能及损伤情况；免疫组化、Western印迹检测肾组织受体相互作用蛋白(RIP)3、Caspase-3、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)的表达情况。结果与对照组相比，糖尿病组系膜细胞基底膜增厚，细胞外基质堆积，RIP3、Caspase-3、PARP表达增多，阿格列汀组肾脏病理损伤较轻，相应表达减少，但比对照组稍多，Western印迹结果阿格列汀组相对对照组变化不大。结论阿格列汀可能通过改善细胞凋亡通路中的死亡受体通路中的RIP3的表达改善肾脏细胞的凋亡程度，延缓肾脏病理损伤的进展。

阿格列汀；糖尿病肾病；细胞凋亡；受体相互作用蛋白3；聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶

在糖尿病(DM)血管病变并发症中，肾病导致心脑血管病变的发生、发展是引起终末期肾衰竭的主要原因之一〔1〕。糖尿病肾病(DN)的发生、发展是一个慢性而又复杂的过程。已有研究证实高糖诱导引起的氧化应激导致足细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞凋亡〔2〕。目前认为有3条通路参与凋亡的发生：线粒体通路，死亡受体通路和内质网通路〔3〕。其中，受体相互作用蛋白(RIP)3具有自磷酸化、诱导细胞凋亡和(或)坏死及激活核转录因子(NF)-κB的作用，是参与肿瘤坏死因子(TNF)-α介导的死亡受体凋亡通路的信号分子〔4〕。本实验探讨RIP3是否在肾脏细胞凋亡通路中起作用及阿格列汀能否改善DN肾脏病理损伤及细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1动物及分组 8周龄清洁级雄性Wistar大鼠50只，体重200 g，购自山东大学医学院实验动物中心。适应性喂养1 w后，随机选10只作为对照组，DM组和阿格列汀组各20只，腹腔注射柠檬酸缓冲液溶解的链脲佐菌素(STZ，浓度2%)65 mg/kg构建DM模型。第3天测血糖(测血糖前需禁食12 h)，1 w后再测，随机血糖>16.7 mmol/L视为造模成功，实验过程中DM各组不符合标准者予以剔除。待模型稳定后，给予对照组、DM组生理盐水灌胃，阿格列汀组以一定剂量阿格列汀研钵磨碎后生理盐水稀释灌胃，21 w末称重，处死动物取材。

1.2标本收集与处理 各组大鼠于21 w末于尾静脉取血测血糖、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。血糖由血糖测量仪、血糖试纸检测。各组大鼠于第21周末处死提前1 d以代谢笼收取24 h尿液标本，加入甲苯防腐，记录尿量，同时离心后取上清液置-20℃冰箱中保存备用，用于测定尿微量白蛋白。血、尿生化指标均由全自动生化分析仪测定。

1.3肾脏病理学观察 各组大鼠于21 w末腹腔注射水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，取出双肾，剥去肾包膜，称取肾脏重量，并记录，计算肾脏肥大指数(肾重/体重)，同时一部分肾脏放入4%多聚甲醛中以备制作石蜡切片，一部分投入液氮中12 h，然后置于-80℃冰箱中，以备Western印迹实验。将标本从多聚甲醛中取出，流水冲洗3～4 h后脱水，石蜡包埋，用石蜡切片机切成4 μm的切片。

1.3.1HE染色 石蜡切片烤片30 min左右→脱蜡至水(二甲苯Ⅰ、Ⅱ，梯度酒精浸泡)→苏木素染色2～3 min→蒸馏水冲洗一下→盐酸酒精分化5 s→流水冲洗5 min→伊红染色2～3 min→流水冲洗5 min→脱水透明→中性树胶封片，显微镜观察。

1.3.2PAS染色 石蜡切片烤片30 min左右→脱蜡至水→0.5%过碘酸溶液氧化10 min→蒸馏水充分洗涤5 min，3次→Schiff试剂染色40 min左右→亚硫酸冲洗液处理切片3次，每次2 min→流水冲洗10 min→苏木素染核2～3 min→蒸馏水冲洗一下后盐酸酒精分化5 s→流水冲洗5 min→脱水透明→中性树胶封片。

1.3.3Masson染色 石蜡切片烤片约30 min→脱蜡至水→Masson复合染色液染色5 min→0.2%醋酸溶液清洗2次，每次1 min→5%磷钨酸3 min→0.2%醋酸溶液清洗2次，每次1 min→亮绿染色30 s，0.2%醋酸水洗2次→脱水透明→中性树胶封片。

1.3.4天狼星红染色 石蜡切片烤片30 min左右→脱蜡至水→天狼星红饱和苦味酸液染1 h左右→流水冲洗10 min→脱水透明→中性树胶封片，偏振光显微镜观察。

1.4免疫组化法检测肾组织受体相互作用蛋白(RIP)3、Caspase-3及聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶蛋白(PARP)表达 烤片30 min左右→脱蜡至水→EDTA抗原修复，高火2 min 40 s，低火15 min→自然冷却约1 h→磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，每次3 min→3%H2O2室温孵育15 min→PBS洗3次，各3 min→5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，20 min→滴加适当稀释的一抗，4℃过夜(12～16 h)→37℃复温，45 min→PBS洗3次，各3 min→滴加生物素标记的山羊抗兔IgG，37℃40 min→PBS洗3次，各3 min→DAB显色，镜下控制显色时间，直至出现棕黄色颗粒→流水冲洗→苏木素复染核2～3 min，冲洗之后盐酸酒精分化5 s，流水冲洗10 min→脱水透明→中性树胶封片，显微镜观察。

1.5Western印迹检测肾组织RIP3、Caspase-3、PARP表达 取-80℃冻存的肾脏组织剪碎、研磨提取蛋白→BCA法测蛋白浓度→配胶、上样→电泳80 mV 2 h左右→切胶、转膜200 mV 2 h左右→牛奶封闭1 h→1×TBST洗膜3次，每次5 min→敷一抗(1∶1 000)，4℃过夜(16 h)→1×TBST洗膜3次，每次15 min→敷生物素标记的山羊抗兔IgG 2 h→1×TBST洗膜3次，每次15 min→ECL显色，ImageJ软件对条带进行分析，计算灰度值。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0软件行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1各组大鼠一般情况 注射STZ后，DM组血糖明显升高，开始出现多饮、多食、多尿的症状，体重明显减轻，精神状态较差，阿格列汀组较DM组情况有所改善。

2.2各组大鼠肾脏组织病理改变 DM组肾脏肥大指数较对照组明显增大(P<0.01)，阿格列汀组较DM组明显改善(P<0.01)。DM组HE染色与PAS染色同对照组相比，基底膜增厚，系膜基质增多，细胞外基质沉积，肾小球体积增大，血管壁玻璃样变性、肾小管细胞空泡样变性、纹理变乱等。基底膜以及系膜的改变在PAS染色中较为明显。阿格列汀组病理损伤较DM组轻。Masson染色以及天狼星红染色与对照组相比，Ⅰ型胶原(红色)、Ⅳ胶原(淡黄色)表达量增多，胶原纤维排列紊乱、分布不均，主要集中在肾小球系膜区，肾小管基底膜，阿格列汀组与DM组相比胶原表达量下降。见图1。

2.3各组大鼠生化指标检测 与对照组相比，DM组造模成功后血糖持续在11.1 mmol/L以上，有显著差异(P<0.01)，Scr、BUN随着饲养时间的延长，与对照组相比逐渐增加(P<0.01)，尿白蛋白排泄率(UAER)于12 w末与对照组相比含量明显增高(P<0.01)，阿格列汀组与DM组相比各指标明显改善(P<0.01)，见表1。

图1 各组大鼠肾脏病理学改变(×200)

组别体重(g)肾重(g)肥大指数(‰)血糖(mmol/L)BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)UAER(μg/min)对照组363.64±8.391.37±0.024.33±0.105.54±0.146.65±0.1855.8±1.393.76±0.07DM组204.94±7.681)1.64±0.011)8.00±0.301)24.79±1.441)15.89±1.051)88.38±0.951)22.99±1.301)阿格列汀组243.27±6.361)2)1.54±0.021)2)6.37±0.191)2)20.66±0.421)2)12.21±0.841)2)73.93±0.871)2)15.31±0.751)2)

与对照组比较：1)P<0.01；与DM组比较：2)P<0.01

2.4免疫组化检测各组肾组织RIP3、Caspase-3、PARP表达 RIP3主要在胞质中表达，DM组表达量较对照组明显增多，主要集中在肾小管，阿格列汀组表达量下降(P<0.05)，Caspase-3在胞质、胞核中均有表达，DM组表达量较对照组明显增加，主要集中在肾小管，肾小球中也可见部分棕黄色颗粒，阿格列汀组表达量相对DM组表达量显著减少(P<0.05)。PARP主要在胞核中表达，DM组较对照组增多，在肾小管、肾小球均有表达，肾小管周围颇多，阿格列汀组明显下降(P<0.05)，见图2，表2。

图2 免疫组化检测各组大鼠肾组织RIP3、Caspase-3、PARP表达(DAB，×200)

组别RIP3Caspase-3PARP对照组285.57±7.083256.30±61.56861.99±72.60DM组8892.59±387.031)9873.69±133.741)8626.17±273.561)阿格列汀组4125.23±320.442)4853.77±131.662)2805.53±157.442)

与对照组比较：1)P<0.05；与DM组比较：2)P<0.05，下表同

2.5Western印迹检测各组大鼠肾组织RIP3、Caspase-3、PARP表达 与对照组相比，DM组RIP3、Caspase-3、PARP表达量明显升高，而阿格列汀组较DM组表达量减少(P<0.05)，但与对照组相比无明显改变(P>0.05)。见图3，表3。

1～3：对照组、DM组、阿格列汀组图3 Western印迹检测各组大鼠肾组织RIP3、Caspase-3、PARP表达

组别RIP3/β-actinCaspase3/β-actinPARP/β-actin对照组1.40±0.102.22±0.111.12±0.07DM组1.80±0.071)2.67±0.161)1.73±0.071)阿格列汀组1.61±0.092)2.32±0.112)1.29±0.112)

3 讨 论

DN的发病是慢性且复杂的过程，最终引起肾小球肥大，肾小球基底膜增厚，胶原沉积，随着肾脏功能的逐渐失调，肾小管萎缩、间质纤维化加重〔5，6〕。细胞凋亡在DN的发展过程中起着重要作用，高糖状态下，促使细胞凋亡的诱导因素如氧化应激、炎症反应等使得凋亡的强度大于细胞增生的速率，导致组织细胞数量减少，系统功能失调〔7，8〕。RIP3作为一类重要调节细胞死亡或存活的信号分子，广泛表达于胚胎和大量成熟组织〔9〕，在TNF-α诱导的细胞凋亡中，TNF-α受体(TNFR)1与TNF-α受体相关死亡结构域TRADD募集，经过一系列反应，RIP3被募集到TNFR1复合物1〔10〕，表现出促凋亡的活性。过量表达RIP3会诱导细胞凋亡，也会引发TNF-α诱导的Caspase依赖的细胞凋亡〔11〕，可能会引发肾小管上皮细胞过度凋亡。Caspase-3作为执行细胞凋亡的终末剪切酶，将底物多聚聚合酶PARP剪切成31 kD和85 kD两个片段，引起DNA损伤，DNA修复功能丧失，导致细胞凋亡〔12〕。本实验通过免疫组化、Western印迹检测RIP3、Caspase-3、PARP三个指标的表达情况，从细胞凋亡的水平发现DM组这三个指标表达均增加，与细胞凋亡通路分子水平变化相一致。DPP-Ⅳ抑制剂比如西格列汀、阿格列汀等，作为治疗糖尿病的新型药物，在不引起低血糖的状态下可以减缓肠促胰岛素效应降低的速率〔13〕。一些研究报告指出阿格列汀，作为DPP-Ⅳ抑制剂，对一些组织具有保护作用，比如心脏、肾脏、胰腺、视网膜等〔14〕。阿格列汀通过抑制二肽基肽酶-Ⅳ的活性延长胰高血糖素样肽(GLP)-1的降解时间，可以纠正糖代谢紊乱，防止肾脏损伤〔15〕。由于GLP-1在血液中易被DPP-Ⅳ在数分钟内降解，DPP-Ⅳ抑制剂如阿格列汀可以延缓二肽基肽酶Ⅳ降解的时间，增强GLP-1生物学活性，降低血糖〔16〕。已有研究证明在胆管细胞、神经元细胞、内皮细胞，GLP-1通过改善Bcl-2家族蛋白水平的表达水平减轻细胞凋亡率〔17〕，但是并没有确切的证据表明阿格列汀是否能够从细胞凋亡的水平改善肾脏损伤。本实验通过研究发现，药物干预后的老鼠血糖水平降低，通过观察病理改变肾脏组织病理损伤也相应减轻，系膜区胶原沉积减少，细胞外基质堆积减少等，与文献研究报道相一致〔18〕，通过阿格列汀的药物干预，肾脏细胞凋亡的程度有所减轻，改善肾脏损害的进行性损伤。

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〔2016-04-03修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

R589

A

1005-9202(2017)18-4437-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.004

山东省科技发展计划项目(No.2013G0021813)；山东省中医药管理局(No.2011-029)；济南市高校自主创新计划(No.201401218)；中国心血管医师研究基金(2014)

郑 杰(1989-)，女，硕士，医师，主要从事心血管疾病基础及临床研究。