刘 莹 蒋敦科 李素艳 井 洁 林瑶光

(广西医科大学第一附属医院老年消化内科，广西 南宁 530021)

白藜芦醇通过上调结肠癌HCT116细胞内凋亡相关分子表达促进细胞凋亡

刘 莹 蒋敦科 李素艳1井 洁 林瑶光

(广西医科大学第一附属医院老年消化内科，广西 南宁 530021)

目的探讨白藜芦醇影响结肠癌生物行为的机制。方法采用结肠癌HCT116细胞，采用体外CCK8实验观察白藜芦醇对结肠癌HCT116细胞增殖的影响；采用TUNEL凋亡实验观察白藜芦醇对结肠癌HCT116细胞凋亡的影响；采用实时定量PCR及Western印迹检测与凋亡相关分子的表达。结果CCK8实验结果显示，相比于未经白藜芦醇处理的结肠癌HCT116细胞，体外处理结肠癌HCT116 24 h后，随着白藜芦醇剂量(25、50、100 μmol/L)的逐渐上调，结肠癌HCT116细胞的活力逐渐下调。TUNEL凋亡实验显示，相比于未经白藜芦醇处理的结肠癌HCT116细胞，白藜芦醇50 μmol/L生理剂量可明显上调结肠癌HCT116细胞的凋亡染色率。实时定量PCR 与Western印迹实验显示，在白藜芦醇生理剂量(50 μmol/L)的处理下，相比于未经白藜芦醇处理的结肠癌HCT116细胞，凋亡相关基因Bax和Bad的表达均上调。结论白藜芦醇通过上调结肠癌HCT116细胞内凋亡相关分子表达促进细胞凋亡。

白藜芦醇；结肠癌；凋亡

据最新研究显示，每年有超过3 000万人被诊断为结肠癌〔1〕。但其临床症状不典型，发现时大多已进展至晚期。外科手术切除病变组织是目前治疗结肠癌的主要手段〔2〕，但大多经外科治疗的结肠癌患者，表现出较高复发及低预后〔3〕。白藜芦醇是一种天然多酚，最开始在红葡萄皮中被发现〔4〕，也存在于一些药用植物中。目前，白藜芦醇是一类广泛应用的肿瘤预防试剂〔5〕。研究显示，白藜芦醇可延缓结肠癌患者生存率及肿瘤中位扩散时间，并且一定剂量白藜芦醇可明显抑制胃癌细胞的发生及发展〔6〕。白藜芦醇在结肠癌防治及治疗过程中的重要发现及白藜芦醇在胃癌细胞中的实验现象表明，白藜芦醇可干预结肠癌细胞的发生与发展〔7〕。本文采用体外细胞分子生物学实验，观察生理剂量白藜芦醇对人结肠癌细胞HCT116生物学的影响。

1 材料与方法

1.1细胞、培养基与试剂 HCT116(购于美国模式细胞公司ATCC)，培养基DMEM、0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS， Gibco公司)。双抗——青链霉素，Trizol核酸裂解液，逆转录试剂盒，qPCR试剂盒(碧云天公司)，白藜芦醇(美国Gibco公司)。参考相关的文献资料〔6〕，给予不同的体外处理方法，并据此分成未经白藜芦醇处理(对照组)，白藜芦醇处理 25 μmol/L剂量组,白藜芦醇处理 50 μmol/L剂量组(生理剂量)，白藜芦醇处理100 μmol/L剂量组。

1.2八肽胆囊收缩素(CCK8)增殖检测实验 培养人结肠癌细胞，待其生长稳定后，消化细胞，提前1 d以30%密度接种于96孔板(Hyclone公司)。随后5 d，每天以1∶10的比例加入CCK8试剂，37℃孵育2 h，吸取上清液，紫外分光光度仪测量450 nm下OD值。

1.3提取RNA 0.25% 胰蛋白酶收集对数期细胞，加入适量Trizol，冰上孵育15 min、12 000 r/min离心10 min，75%乙醇清洗沉淀，沉淀溶于焦炭酸二乙酯(DEPC)水，保存于-70℃。

1.4实时定量PCR(qPCR) 提取总RNA反转录成cDNA,进行荧光定量PCR反应。反应条件：95 ℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s 40个循环，72℃末次延伸5 min。采用2-ΔCT法进行相对定量分析。

1.5TUNEL法检测细胞凋亡 将细胞以70%～80%的密度提前1 d爬片，用生理剂量(50 μmol/L)白藜芦醇处理4 h，固定，加入TUNEL反应液，光学荧光显微镜下观察细胞凋亡比率。

1.6Western印迹检测 将细胞用生理剂量(50 μmol/L)白藜芦醇处理4 h后，检测Bcl-2相关X蛋白(Bax)和Bcl-2相关死亡促进因子(Bad)凋亡相关基因的表达。一抗：3'-3'磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)配置比例为1∶10 000，Bad及Bax为1∶200；二抗，GAPDH配置比例为1∶10 000、Bad及Bax为1∶5 000。

1.7统计学方法 应用Graph Pad6.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1白藜芦醇可抑制结肠癌HCT116细胞增殖 体外处理结肠癌HCT116 24 h，相比于未经白藜芦醇处理的结肠癌HCT116细胞，处理后的结肠癌HCT116细胞增殖开始出现显著抑制，且抑制强度随白藜芦醇剂量的增加逐渐上调；致处理结肠癌HCT116细胞72 h，结肠癌HCT116细胞完全死亡。见图1。

1)P<0.01图1 白藜芦醇对结肠癌 HCT116细胞增殖的影响

2.2白藜芦醇可引起结肠癌HCT116细胞凋亡 见图2。相比于未经白藜芦醇处理的结肠癌HCT116细胞，白藜芦醇可明显上调结肠癌HCT116细胞的凋亡染色率。

2.3白藜芦醇通过上调结肠癌HCT116细胞内凋亡相关分子表达以促进细胞凋亡 Realtime PCR结果显示，在白藜芦醇生理剂量(剂量50 μmol/L)的处理下，相比于未经白藜芦醇处理的结肠癌HCT116细胞，Bax和Bad的表达均明显上调，其中Bax上调(15±2.1)倍、Bad上调(12.3±1.2)倍。进一步Western印迹实验显示，在白藜芦醇生理剂量(剂量50 μmol/L)的处理下，相比于未经白藜芦醇处理的结肠癌HCT116细胞，Bax和Bad的表达条带颜色均明显较高。见图3。

图2 白藜芦醇对结肠癌 HCT116细胞凋亡的影响

图3 白藜芦醇通过上调结肠癌HCT116 细胞内凋亡相关分子表达以促进细胞凋亡

3 讨 论

外科手术是目前临床治疗结肠癌的主要方法〔7〕。腹腔镜低创伤度、高视野范围的临床优势，使得其越来越多地应用于临床各科的手术治疗中〔6〕。结肠癌经早期外科治疗可显著提升患者生存率及预后。但基于结肠癌临床表现不典型、早期发现率低等特点，临床上对于结肠癌的早期干预度较低，结肠癌发现时多半已有转移〔8〕。研究表明，术后化疗药物，包括顺铂、多柔比星及博莱霉素等药物具有明显的消化系统(恶心，呕吐)、血液系统(白细胞减少、血小板降低)的副作用〔9〕；并且，术后化疗药物的广泛应用不能有效遏制结肠癌肿瘤细胞的复发。白藜芦醇是一类提取于植物内的天然多酚类物质，主要存在于红葡萄果皮中，在神经保护、促神经相关祖细胞分化、肿瘤预防及辅助治疗等方面的作用逐渐被发现。前期有研究报道，肺癌、结肠癌、胃癌患者在使用放化疗的同时联合口服白藜芦醇，可明显延长患者的中位生存期，并提高3年、5年的生存率〔10〕。本研究结果表明，白藜芦醇可抑制结肠癌HCT116细胞增殖，可引起结肠癌HCT116细胞凋亡，且通过上调结肠癌HCT116细胞内凋亡相关分子表达以促进细胞凋亡。

1Senicourt B,Boudjadi S,Carrier JC,etal.Neoexpression of a functional primary cilium in colorectal cancer cells〔J〕.Heliyon,2016;2(5):e00109.

2Liang X,Luo M,Wei XW,etal.A folate receptor-targeted lipoplex delivering interleukin-15 gene for colon cancer immunotherapy〔J〕.Oncotarget,2016;7(32):52207-17.

3Ogata K,Takamori H,Hmezaki N,etal.Gastrointestinal perforation during regorafenib administration in a case with hepatic metastases of colon cancer〔J〕.J Chemother,2016;20(1):1-3.

4Niedzwiecki D,Frankel WL,Venaok AP,etal.Association between results of a gene expression signature assay and recurrence-free interval in patients with stage Ⅱ colon cancer in cancer and leukemia group B 9581(Alliance)〔J〕.J Clin Oncol,2016;34(25):3047-53.

5Chu QD,Zhou M,Medeiros K,etal.Positive surgical margins contribute to the survival paradox between patients with stage IIB/C(T4N0)and stage IIIA(T1-2N1,T1N2a)colon cancer〔J〕.Surgery,2016;160(5):1333-43.

6Ediriweera DS,Kumarage S,Deen KI.Comparison of hazard of death following surgery for colon versus rectal cancer〔J〕.Ceylon Med J,2016;61(2):52-5.

7Tashiro Y,Murakemi M,Otsuka K,etal.Intrathoracic Hernia after total gastrectomy〔J〕.Case Rep Gastroenterol,2016;10(1):1-6.

8Chen HJ,Wei Z,Sun J,etal.A recellularized human colon model identifies cancer driver genes〔J〕.Nat Biotechnol,2016;34(8):845-51.

9Rizzuto A,Palaia I,Vescio G,etal.Multivisceral resection for occlusive colorectal cancer:Is it justified〔J〕? Int J Surg,2016;33(1):S142-7.

10Groom K,Penna M,Arul D,etal.Capecitabine-related liver lesions:sinusoidal dilatation mimicking liver metastasis〔J〕.Clin Case Rep,2016;4(6):545-8.

〔2017-03-22修回〕

(编辑 袁左鸣)

R73

A

1005-9202(2017)18-4500-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.030

1 广西医科大学第二附属医院老年消化内科

刘 莹(1977-)，女，硕士，主治医师，主要从事老年消化疾病研究。