刘丽清，周三女

（宁德职业技术学院，福建 福安355000）

葡萄是世界公认的一种营养丰富的水果作物，含有丰富的有益健康的化合物。白藜芦醇是葡萄的主要生物活性成分之一，是一种植物抗毒素，在环境因子的刺激下，在果皮、植物茎和根中积累。由于白藜芦醇具有多种药理作用，包括保护心脏、抗炎、抗癌和抗氧化特性[1-2]，受到了广泛的关注。

近年来，白藜芦醇在多种哺乳动物信号通路中的活性得到了广泛的研究。例如，白藜芦醇被认为是一种抗癌、抗衰老和神经保护剂，因为其可以控制那些调节DNA 合成和细胞周期的蛋白质，以及合成那些控制细胞增殖和应激适应的因子[3-5]。此外，白藜芦醇被发现具有抗氧化性，通过用UVB 照射人的角质细胞（HaCAT） 显示，白藜芦醇以细胞凋亡和自噬结合的方式启动皮肤光化学保护机制，用来预防皮肤癌[6]。

一般来说，葡萄皮、茎和种子组成的葡萄果渣占新鲜果实的20%～25%（按质量计算），含有大量的白藜芦醇和其他生物活性物质[7]，然而，其通常是葡萄加工过程中的副产品。葡萄皮中含有丰富的白藜芦醇及其糖苷，而果肉中的含量相对较低。因此，最近有人研究了葡萄皮或果渣作为抗氧化剂的可持续来源的可能性[8]。在葡萄皮中，大部分白藜芦醇是以其糖苷的形式存在，称为白藜芦醇苷，白藜芦醇苷不容易在小肠内吸收，在啮齿类动物中，肠道表皮参与了白藜芦醇苷对白藜芦醇的代谢，以促进其吸收到血液中[9]。

考虑到白藜芦醇具有显著的潜在健康效益，且比白藜芦醇苷更具生物可利用性，因此必须开发通过各种定量提取技术或直接白藜芦醇苷脱糖的高效可行的方法来提高白藜芦醇产量。多年来，从葡萄皮中提取白藜芦醇一直具有挑战性，因为它在水和其他常用溶剂中的溶解度较低。迄今为止，用乙醇水溶液（80/20，V/V） 在60 ℃下轻轻搅拌30 min，从感染发霉的葡萄皮中获得了最佳的白藜芦醇苷和白藜芦醇的提取量[10]。为了进一步提高从植物源提取白藜芦醇的产量，还研究了将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的各种附加程序；这些步骤包括酸解、加热和酶催化[11-13]。然而，这些程序的成本昂贵，而且往往需要最大程度的反应时间。近年来，在白藜芦醇苷直接生物转化的方法中设计并使用了高度固定化的食用黑曲霉和酵母[7]，优化了虎杖根的生物转化条件，使虎杖根的白藜芦醇产量是未处理虎杖根的11 倍。

试验探索了运用酶催化与热处理相结合从葡萄皮中快速、简便、直接提取白藜芦醇及其糖苷的方法。尤其是对葡萄皮进行预热，使其细胞壁特性发生物理变化，从而有可能增加其对酶催化过程的敏感性，然后用包括exo-β-1,3- 葡聚糖酶和PG 酶VinoTaste 脯氨酸混合剂处理，以促进白藜芦醇苷向白藜芦醇的生物转化。PG 水解成(1,4)-±-D- 半乳糖醛酸酶链作用于水果细胞壁降解，而exo-β-1,3-葡聚糖酶水解成非还原性末端多糖(1,3)-2-D- 葡聚糖。预热条件优化，定量测定了葡萄皮提取物（GPEs）的抗氧化性能，确保加热不会引起相关物质的变质。因此，研究旨在创造最佳条件来最大限度地从葡萄皮中回收白藜芦醇和抗氧化成分。

1 材料和方法

1.1 原料及化学品

巨峰葡萄品种是福安本土种植的主要品种，果胶酶Rohament（纤维素酶，17 200 U/g），北京杰辉博高生物技术有限公司提供；果胶酶Pectinex（聚半乳糖醛酸酶，3300 PGN U/g）、脯氨酸VinoTaste [PG（2500 PG U/g） 和exo-β-1,3- 葡聚糖酶（75 U/g）、Viscozyme(endo-1,3(4)-exo-β-1,3-葡聚糖酶（100 真菌性exo-β-1,3-葡聚糖酶U/g）、2- 葡糖苷酶（10～30 U/g）、exo-β-1,3-葡聚糖酶（212 U/mg） 等。

白藜芦醇苷（95%纯度） 和白藜芦醇（99%纯度），国家标准物质中心提供；乙醇、甲醇和磷酸，上海联试化工试剂有限公司提供；用于过滤高效液相色谱（HPLC） 分析样品的注射器过滤器（PVDF滤膜，0.45 和0.2 μm），北京梦怡美生物科技有限公司提供；用于高效液相色谱分析的乙腈和甲醇均为高压液相层析级，上海联试化工试剂有限公司提供；除另有规定外，所有其他试剂均为分析级，无需进一步纯化即可使用。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱分析（HPLC）：采用装配有MD 2010 Plus 系列波长检测器的2000 Plus 系列高效液相色谱对GPE 进行了HPLC 分析。样本分离是使用双层的5 μm C18色谱柱（150 mm×2 mm） 在0.8 mm/min的流速和一组梯度溶剂中分离，A/B（90/10，V/V）0～5 min，A/B（80/20， V/V） 5～25 min， 和A/B（90/10，V/V）为25～30 min（溶剂A：0.015 mol/L 磷酸水；溶剂B：乙腈）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品提取物中白藜芦醇和白藜芦醇苷的鉴定

采用UPLC 与配备电喷雾电离源的三倍四极质谱仪（LC-MS/MS 8040） 自动鉴定葡萄皮提取物中的反式白藜芦醇和白藜芦醇苷。UPLC 系统使用Kinetex C18色谱柱（100 mm×2.6 μm） 在0.2mL/min 的流速下在梯度溶液从A/B（10/90，V/V） 到A/B （50/50，V/V） 运行0～3 min，以及在A/B（10/90，V/V） 溶液中运行3.1～7.0 min（溶剂A：0.024 mol/L甲酸乙腈溶液；溶剂B：0.024 mol/L甲酸水溶液）。标准物质和样品直接注入光谱仪，注入体积都为5 μL。MS/MS 系统加热毛细管温度保持在250 ℃，氮气干燥气体保持8 L/min 流速。同时，创建了线性度为0.99的白藜芦醇和白藜芦醇苷的标准曲线。对相关的化合物进行鉴定，并通过选定的反应监测进行了定量，制备未加热的葡萄皮样品作为对照。结果用μg/g表示。

1.3.2 纯白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的去糖基化

初步制备了100 mg/mL 的白藜芦醇苷原液作为母液。然后，在10 μL 母液中加入1 mL 的100 mmoL/L醋酸钠溶液（pH 值5.0），分别用酶如：纤维素酶（344 U/mL），Viscozyme（2 U/mL），葡 糖 苷 酶（6 U/mL） 和VinoTaste脯氨酸（0.015 U/mL）在50 ℃分别处理10，20，30，60，120 min。酶催化水解完成后，加入1 mL 甲醇到500 μL 的反应混合物中，然后为了反应完全，在95 ℃持续加热3 min。溶液通过注射器过滤器（PVDF，0.45 μm） 过滤，用HPLC 检测其在303 nm 的吸光度，用超性能液相色谱- 质谱联用仪（UPLC-MS/MS） 对样品进行分析。标准白藜芦醇和白藜芦醇苷的UPLC-MS/MS 谱图和裂解模式和文献[19]吻合。同时，制备了包含除酶以外的所有试剂的样品作为对照进行分析。

1.3.3 冻干葡萄果皮样品的制备

新鲜葡萄皮是通过挤压葡萄果肉而得到。称量约500 g 新鲜葡萄皮，与约250 mL 蒸馏水混合，在搅拌机中搅匀。将得到的混合物冷冻干燥，浓缩葡萄皮中所需的物质，便于后续分析处理。

1.3.4 加热和酶催化联用的提取白藜芦醇的初步试验

称量冷冻干燥样品0.5 g，加入约3 mL 蒸馏水，95 ℃条件下加热1 h。然后，蒸干水分，用3 mL 5 U/mL 的2 - 葡糖苷酶和VinoTaste脯氨酸在单独的试管里进行酶催化处理。然后，将其溶解在醋酸盐缓冲液（pH 值5.0） 中，用适当体积的乙醇制备乙醇水溶液（80/20，V/V），加入乙醇水溶液，终止反应。然后按照上述方法提取白藜芦醇[10]。简单地说，白藜芦醇的提取是在60 ℃下加热30 min，用乙醇- 水混合物（80/20，V/V） 在热摇瓶中进行。然后，最终提取物蒸发干燥后再溶解在1 mL 的乙醇水溶液（80/20，V/V），用注射器过滤器（Whatman PVDF 过滤器，0.45 μm） 进行过滤，最后用高效液相色谱法对提取液进行分析。白藜芦醇苷和白藜芦醇的含量用μg/g 表示。

1.3.5 优化从葡萄中提取白藜芦醇和白藜芦醇苷的预热温度

称量冷冻干燥样品0.5 g，加入约3 mL 蒸馏水，随后在不同温度（35，55，75，95 ℃） 条件下加热10，30，60 min。将室温下未加热的葡萄皮作为参照，再采用之前所述的方法提取白藜芦醇[10]。然后，将最终提取物蒸发干燥后再溶解在1 mL 的乙醇水溶液（80/20，V/V），用注射器过滤器（Whatman PVDF过滤器，0.45 μm） 进行过滤。同时，制备一组未加热和酶处理的葡萄样品（室温，约25 ℃） 作为对照。最后，用高效液相色谱法对提取液进行分析。白藜芦醇苷和白藜芦醇的含量用μg/g 表示。

1.3.6 加热和酶催化处理葡萄皮的联合应用

称量冷冻干燥样品0.5 g，加入约3 mL 蒸馏水，在95 ℃条件下加热10 min，风干，缓慢与3 mL 醋酸钠缓冲液（pH 值5.0） 混合，然后分别用VinoTaste脯氨酸（exo-β-1,3- 葡聚糖酶，5 个单位），Pectinex（聚半乳糖醛酸酶PG，5 个单位），exo-β-1,3- 葡聚糖酶（5 个单位），2- 葡糖苷酶（5 个单位），以及Pectinex和exo-β-1,3-葡聚糖酶（5 个单位） 混合物进行酶催化处理。用0.1 mol/L HCl 溶液或NaOH 溶液调节pH 值至5.0，反应的混合物在热摇瓶里50 ℃条件下培育60 min。未经加热和酶催化处理过的室温下的葡萄皮作为参照。然后，按照前面提到的最佳条件进行白藜芦醇的提取。最终提取物蒸发干燥后再溶解在1 mL 的乙醇水溶液（80/20，V/V），通过沃特曼过滤器（Whatman PVDF过滤器，0.2 μm） 进行过滤用于HPLC 分析。白藜芦醇苷和白藜芦醇的含量用μg/g 表示。

2 结果与分析

2.1 纯白藜芦醇苷向白藜芦醇的酶转化

为了创造最佳条件以便从白藜芦醇的前导糖苷中产量最大化获得白藜芦醇，纯白藜芦醇苷用不同的酶进行催化处理，如纤维素酶、Viscozyme、2-葡糖苷酶和VinoTaste脯氨酸。对纤维素酶和Viscozyme进行了筛选，比较了纤维素酶、Viscozyme与2- 葡糖苷酶和VinoTaste脯氨酸在白藜芦醇苷转化为白藜芦醇过程中的效率。研究发现，白藜芦醇苷在40 ℃条件下培育10～120 min，然后去糖基化，2-葡萄糖苷酶和VinoTaste脯氨酸比纤维素酶和Viscozyme更为有效（图1）。用VinoTaste脯氨酸催化得到的白藜芦醇产量比2- 葡糖苷酶、Viscozyme和纤维素酶分别提高了6.09%，34.29%，81.33%。因此，在后续试验中采用VinoTaste脯氨酸。另外，在使用VinoTaste脯氨酸催化白藜芦醇苷去糖基化的时间过程图中表明，纯白藜芦醇苷在50 ℃条件下，用酶催化处理60 min 后可全部转化为白藜芦醇（图2）。

不同酶作用下白藜芦醇苷向白藜芦醇转化率见图1，在不同加热时间VinoTaste脯氨酸作用下白藜芦醇苷向白藜芦醇的转化率见图2。

图1 不同酶作用下白藜芦醇苷向白藜芦醇转化率

图2 在不同加热时间VinoTaste脯氨酸作用下白藜芦醇苷向白藜芦醇的转化率

在所有酶催化试验中，尽管报道了纤维素酶在白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的过程中的作用，但其作用是最小的[14]。根据供应商的分析，Viscozyme同样被报道具有纤维素酶的功用，有望以与纤维素酶类似的方式完成白藜芦醇苷的去糖基化，所以和其他的酶一起进行了测试。用VinoTaste脯氨酸参加反应得到白藜芦醇的高回收率可能要归功于2-1，3-葡聚糖酶的活性，2-1，3- 葡聚糖酶直接水解2-1，3 链作用于白藜芦醇苷。在白藜芦醇苷水解过程中，采用合适的酶直接攻击2-1，3- 链是非常重要的。结论和之前的报道一致，在60℃，pH 值5.0，基质质量浓度为40 g/L 的最佳酶催化条件下，用5 U/mL的白藜芦醇苷、2-D- 葡糖苷酶活化4 h，完成白藜芦醇苷向白藜芦醇生物转化，从米曲霉中提炼的白藜芦醇苷-2-D- 葡糖苷酶在这一过程中是有作用的[15]。为了解决产量低、工业相溶性差的问题，研究人员尝试了多种白藜芦醇苷向白藜芦醇转化的方法，包括微生物转化和酸水解，收效甚微[16-17]。

2.2 葡萄皮中提取白藜芦醇的加热温度和时长的作用

考虑到预热和酶处理是白藜芦醇提取的关键决定因素[10，18]，葡萄皮在不同温度和时间下加热，以确定最佳的预热条件（表1）。在不使用酶的情况下，单独在75 ℃或更高温度下热处理10～60 min，白藜芦醇的提取率明显提高。葡萄皮在75 ℃下热预处理60 min 和95 ℃下热预处理10 min 用乙醇水溶液（80/20，V/V） 作为萃取溶剂产生的白藜芦醇最高提取率为113.54 μg/g 干葡萄皮、113.99 μg/g 干葡萄皮。这些提取率明显高于其他加热条件下。

预加热对葡萄皮中白藜芦醇苷和白藜芦醇提取的影响见表1。

表1 预加热对葡萄皮中白藜芦醇苷和白藜芦醇提取的影响

另外，葡萄皮提取物中的白藜芦醇苷和白藜芦醇的含量不进行热预处理时分别是19.09，20.65 μg/g干葡萄皮。通过对比，95 ℃下预热10 min 后，提取物中白藜芦醇苷和白藜芦醇含量分别提高2.2 倍和 5.5 倍，统计检验差异p＜0.05。表明在高温下对葡萄皮进行短期热处理对提高白藜芦醇的提取率至关重要。

总的来说，选择95 ℃预热10 min 作为后续工艺的最佳条件。为了防止加热时间过长导致葡萄皮中其他组分的分解，葡萄皮的短暂热处理是最合适的。

2.3 葡萄皮中提取白藜芦醇的加热和酶催化联用的作用

相比于没有加热的参照物，预加热葡萄皮然后酶催化处理明显提高了白藜芦醇及其糖苷的提取量（表2）。特别是葡萄皮预热后使用VinoTaste脯氨酸白藜芦醇的含量显著提升到了93.44 μg/g 干葡萄皮。这是没有加热的参照物的2 倍。另外，白藜芦醇苷的含量保持不变。相对于加热的参照物，使用2- 葡糖苷酶不能显著增加白藜芦醇的含量，仅为81.02 μg/g干葡萄皮。因此，结果明确表明VinoTaste脯氨酸有效催进了预加热葡萄皮中的白藜芦醇配糖转化为苷配基的生物转化。

加热和酶联合作用对白藜芦醇提取量的影响见表2。

表2 加热和酶联合作用对白藜芦醇提取量的影响/μg·g-1

此外，制备了预热并酶组分如PG和exo-β-1,3-葡聚糖酶催化处理的葡萄皮，用来探索VinoTaste脯氨酸酶组分的作用机理。用具有PG 活性的Pectinex处理加热过的葡萄皮。结果表明，在保持白藜芦醇含量不变的情况下，白藜芦醇苷的提取率明显提高。相比较而言，用exo-β-1,3-葡聚糖酶单独处理预热的葡萄皮没有表现出和加热过的参照物有明显区别。有趣的是，Pectinex和exo-β-1,3-葡聚糖酶联合使用则清楚地表现出与用VinoTaste脯氨酸处理过的样品相近的白藜芦醇苷和白藜芦醇含量。因此，这些结果表明PG 进一步提升了在预热过的葡萄皮中白藜芦醇糖苷的提取能力，尽管如此，随后的去糖基反应只有exo-β-1,3-葡聚糖酶存在的情况下才能进行。因此，PG 增强了VinoTaste脯氨酸中的exo-β-1,3-葡聚糖酶的酶催化作用，可能是通过释放对白藜芦醇糖苷基质易于伴随exo-β-1,3-葡聚糖酶辅助水解，从而从预热的葡萄皮样品中提取出大量的白藜芦醇。

不预热处理时，酶法从葡萄皮中提取大量的白藜芦醇苷和白藜芦醇的效果不佳（表1），由此可见，加热处理引起了葡萄皮结构变化，这对于促进白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取，以及白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的有效酶催化反应是至关重要的。同时，使用UPLC-MS/MS 对样品进行分析，监测白藜芦醇苷转化为白藜芦醇的情况，通过对白藜芦醇苷和白藜芦醇的分解模式的评价，UPLC-MS/MS 得到的谱图表明，在消耗白藜芦醇苷的同时产生了白藜芦醇。这2 种色谱图都显示白藜芦醇在227，185，143 m/z处的特征峰，表明GPE 中的白藜芦醇苷去糖基化导致白藜芦醇的生成[19]。

3 结论

一种从白藜芦醇苷转化和从葡萄皮中提取天然白藜芦醇的有效方法。加热后酶处理可显著提高白藜芦醇的提取率。特别是95 ℃条件下预热葡萄皮为10 min，后续用包含exo-β-1,3- 葡聚糖酶和PG 酶VinoTaste脯氨酸在50 ℃条件下处理60 min，显著增加用乙醇水溶液（80/20，V/V） 萃取白藜芦醇的产量达50%。上述白藜芦醇提取方法有望为食品工业提供一种低成本的工业替代方法。