刘宝山，赵芝娜，赵雨杰，王桂珍



肺炎支原体CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的表达及鉴定

刘宝山1，赵芝娜2，赵雨杰3，王桂珍3

目的 探讨肺炎支原体CARDS毒素蛋白多表位拼接抗原的免疫反应活性。方法 对CARDS毒素蛋白的抗原表位进行分析，选取10个重要的表位进行拼接，反向翻译后合成并克隆，插入pET28a表达载体构建pET-CARDS表达质粒并转入受体菌。经IPTG诱导表达的多表位拼接CARDS蛋白使用6×His单克隆抗体和人阳性血清进行了免疫印迹的检测。结果 CARDS毒素蛋白的多表位拼接抗原表达载体构建成功，诱导后表达大小为30KDa的重组蛋白，Western blot测定其能与6×His单克隆抗体和人阳性血清发生反应。结论 本研究选取的CARDS毒素蛋白抗原表位具有较强的免疫活性，可为Mp感染的诊断提供新的候选抗原。

肺炎支原体；CARDS毒素蛋白；多表位拼接抗原；表达；鉴定

肺炎支原体(Mycoplasmapneumonia，Mp)是社区获得性呼吸道感染的重要病原体，约占社区获得性肺炎的10%～40%，并呈增加趋势[1]。其不但引起呼吸系统炎症，而且与哮喘的发病密切相关，并可引起广泛多系统肺外并发症[2-3]。

近年来，一种被称为社区获得性呼吸窘迫综合征(community acquired respiratory distress syndrome，CARDS)毒素的抗原在Mp感染中的作用引起人们的关注。最新研究发现肺炎支原体毒力因子社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(community acquired respiratory distress syndrome toxin，CARDS TX)是由MPN372基因编码的591个氨基酸的蛋白质，主要分布于胞膜和胞质，具有二核酸腺苷核糖转移酶活性[4]，依靠膜联蛋白A2结合真核细胞[5]，参与侵犯呼吸道等病理生理过程[6-7]，因而被认为是Mp的一个重要毒力因子。

2015年司文等在使用重组CARDS毒素蛋白诊断肺炎支原体感染的血清学ELISA试验中，发现其敏感性高于重组P1蛋白，可作为Mp感染诊断的新抗原[8]，但比市售试剂盒的敏感性低。推测这可能是因为其分子量大(约70 kD)，包被时分子结合数量少，一些抗原表位可能会被阻挡，从而导致敏感度下降。为了克服这个缺点，寻找更加有效的抗原位点，提高检测的敏感性，本研究对其候选抗原表位进行了拼接表达，为探讨其抗原活性打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 pET28a(+)表达载体由本试验室保存；其他试剂均为国产。

1.1.2 临床标本来源 临床肺炎支原体感染患者血清收集于中国医科大学附属第四医院，抗体效价大于1∶40 (富士瑞必欧株式会社生产的赛乐迪亚-麦可Ⅱ肺炎支原体抗体检测试剂盒)。

1.2 方法

1.2.1 CARDS毒素蛋白基因的筛选 根据 GenBank中CARDS毒素蛋白 (MPNE_0433)的基因序列 (CP002077.1)，应用在线分析工具 TMHMM进行分析，选取目标抗原表位进行连接，使用大肠杆菌偏好密码子进行反向翻译后，交生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆。

1.2.2 CARDS重组表达载体的构建 提取克隆重组质粒和pET表达载体质粒，分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收CARDS拼接基因片段和线性pET28a载体，连接后转化E.coliBL21(DE3)菌株。挑选克隆菌株进行培养，提取质粒进行酶切鉴定，筛选得到 pET-CARDS阳性菌株。

1.2.3 重组CARDS毒素蛋白的诱导表达 pET-CARDS阳性菌株培养至OD600为0.5时，加入IPTG至1 μg/mL，诱导 pET-CARDS阳性菌株表达CARDS拼接蛋白，5 h后菌液采样进行SDS-PAGE电泳鉴定。

1.2.4 免疫印迹鉴定 诱导菌和未诱导菌进行SDS-PAGE，然后转印至硝酸纤维素膜，分别使用6×His单克隆抗体和人肺炎支原体阳性血清作为一抗，使用HRP标记的蛋白G作为二抗进行免疫印迹，鉴定CARDS拼接蛋白的表达及免疫活性。

2 结 果

2.1 CARDS毒素蛋白基因的筛选 采用生物学软件DNAMAN分析得到CARDS毒素蛋白的抗原表位(表1)，选择具有亲水性的抗原表位(斜体加粗)，使用linker(灰色底纹)进行连接，得到拼接蛋白序列：

将拼接蛋白和CARDS毒素蛋白经SMART在线分析，表明两个蛋白均含有Pfam: Pertussis _ S1结构域，E-Value分别为4e-31和1.1e-126，具有高度的相似性。

然后采用大肠杆菌偏好密码子进行反向翻译，组成588 bp大小的基因序列：

将序列两端分别加上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆。

表1 CARDS毒素蛋白的抗原表位分析列表(斜体加粗为选取的抗原表位)

Tab.1 Analysis of antigenic epitopes of CARDS protein (Italics bold is selected)

No．StartpositionSequenceEndposition14PVRFVYRVDL13265LREYVPE71374RRAYLYE804102RQRQVVF1085122ALRTSFA1286138PIAAANVRSAWLVDAVPVE⁃PGHAHHPAGRVVE1697180NPHYQEL1868194PWLPTPGIATPVHLSIPQAAS⁃VAD217续表No．StartpositionSequenceEndposition9223SASLSFACPD23210243PLDKCIA24911256NLQSLPQYASSVKE26912271EDTPVYLRG27913295NNVFLVEV30214306QKSSFPQTIFFWDVYQRICLKD32715329TGAQISLSLTAFTT34216344YAGQLKVHLSVSAVNA35917369QDSAITQFRVSSEL38218400QHDLYVCPLK40919414DLEELQIIVDECTTHAQFVTM43420437ASTFFVDVQL44621450WRGYYYTPQLSG46122471GQIFYDLKTSKIFFV48523490NVFFLHN49624533LTIPSVEG54025542NFRHIRCYAD55126553QQLKVII55927579EDKILVK585

2.2 pET-CARDS表达载体的构建 构建的重组表达质粒进行酶切鉴定，出现600 bp的条带，与预期结果相符(图1)，表明表达载体构建成功。

M：DL2000 Marker；1：restriction enzyme analysis图1 质粒酶切Fig.1 Restriction enzyme analysis

2.3 重组CARDS毒素蛋白的诱导表达 重组阳性菌株经IPTG诱导后出现一条明显的30 kD的蛋白条带(图2)，与预期重组蛋白大小一致，表明拼接蛋白得到表达。

M：Protein Marker；1：Uninduced bacteria；2：Induced bacteria图2 蛋白的诱导表达Fig.2 Induced expression

2.4 表达蛋白的免疫印迹鉴定 用6×His单克隆抗体进行免疫印迹分析，出现特异性的条带(图3A)。用人肺炎支原体阳性血清作为一抗进行免疫分析，在30 kD处也出现特异性的条带(图3B)。

A：WB by 6 HIS monoclonal antibody；B：WB by Human positive serum M：Protein marker；1：Uninduced bacteria；2：Induced bacteria图3 重组蛋白的免疫印迹Fig.3 Western-blot of rCARDS

3 讨 论

Mp的CARDS 毒素蛋白由591个氨基酸构成，其 N-末端为 ADP-核糖基化活化所必须，C-末端和完整的 CARDS毒素一样有诱导哺乳动物细胞空泡化 (Vacuolization)的作用[4]。因此认为，CARDS毒素蛋白可能为Mp的毒力因子，参与Mp的增殖、接合，并与感染的持久化及呼吸道炎症反应有关。2011年Peters等在难治性哮喘患者的血清标本检测中发现，Mp阳性组、持续阳性组中 CARDS毒素和P1蛋白的IgM抗体显著比Mp阴性组高，从而表明它们具有较好的免疫性，有希望能用来发展一种 Mp的诊断方法[9]。2013年Novella等检测了相关肺炎患者支气管灌洗液中的Mp CARDS毒素的核酸、蛋白及血清中的抗体，结果显示，CARDS毒素DNA、蛋白及抗体的检出率均高于P1蛋白，约40%的被检者CARDS毒素分析阳性[10]。

Kannan等在Mp感染的实验动物模型中，用重组CARDS毒素蛋白和P1黏附蛋白检测感染小鼠血清中的抗体，两种重组蛋白抗原检测的抗体效价无明显差异[2]。2015年司文等重组表达了CARDS毒素蛋白，对肺炎支原体感染血清的ELISA试验，发现其敏感性高于重组P1蛋白，但检测的敏感性仍低于商品试剂[8]。

为提高CARDS毒素蛋白作为包被抗原的敏感性，本研究将其候选抗原表位进行了拼接，表达后可以和肺炎患者的阳性血清发生反应，这提示其具有较好的反应原性，可纯化后进行包被，比较敏感性的高低。

至于拼接蛋白的反应原性是某个抗原表位的作用，还是某些抗原表位的共同作用，以及哪个抗原表位起主导作用，尚需要进行进一步的研究。

[1] Li ZW，Xiao GW，Zhang GX，et al.Mycoplasmapneumoniaeinfection and drug resistance in children in Meizhou area from 2010 to 2014[J]. Chin J Zoonoses，2016，32(03): 306-311.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.019(in Chinese)

李舟文，肖光文，张国雄，等. 梅州地区2010-2014年儿童肺炎支原体感染及耐药情况分析[J].中国人兽共患病学报,2016,32(03):306-311.

[2] Kannan TR，Krishnan M，Ramasamy K，et al. Functional mapping of community-acquired respiratory distress syndrome (CARDS) toxin ofMycoplasmapneumoniaedefines regions with ADP-ribosyltransferase，vacuolating and receptor-binding activities[J]. Mol Microbiol，2014，93(3): 568-581. DOI: 10.1111/mmi.12680

[3] Wang XM，Zheng DX，Liang SY，et al. Analysis of assays to community-acquiredMycoplasmapneumoniaeinfection in the elderly patients[J]. Chin J Zoonoses，2015，31(02): 189-190.DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2015.02.021 (in Chinese)

王希敏，郑东旭，梁双吟，等. 老年获得性肺炎支原体感染的检测与分析[J].中国人兽共患病学报,2015,31(02):189-190.

[4] Becker A，Kannan TR，Taylor AB，et al. Structure of CARDS toxin，a unique ADP-ribosylating and vacuolating cytotoxin fromMycoplasmapneumonia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112(16): 5165-5170. DOI: 10.1073/pnas.1420308112

[5] Somarajan SR，Al-Asadi F，Ramasamy K，et al. Annexin A2 mediatesMycoplasmapneumoniaecommunity-acquired respiratory distress syndrome toxin binding to eukaryotic cells[J]. MBio，2014，5(4): e01497-14. DOI: 10.1128/m Bio.01497-14

[6] TR Kannan OM.MycoplasmapneumoniaeCommunity Acquired Respiratory Distress Syndrome toxin expression reveals growth phase and infection-dependent regulation[J]. Mol Microbiol，2010，76(5): 1127-1141. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2010.07092.x

[7] Kannan TR，Coalson JJ，Cagle M，et al. Synthesis and distribution of CARDS toxin duringMycoplasmapneumoniaeinfection in a murine model[J]. J Infect Dis，2011，204(10): 1596-1604. DOI: 10.1093/infdis/jir557

[8] Si W，Zhou SG，Liu BS，et al. Clinical application of recombinantMycoplasmapneumoniaeCARDS toxin protein in detection ofMycoplasmapneumoniae: A preliminary study[J]. Chin J Microbiol，2015(11): 1262-1265. (in Chinese)

司文，周世冠，刘宝山，等. 重组肺炎支原体CARDS毒素蛋白临床检测应用的初步研究[J].中国微生态学杂志,2015(11):1262-1265.

[9] Peters J，Singh H，Brooks EG，et al. Persistence of community-acquired respiratory distress syndrome toxin-producingMycoplasmapneumoniaein refractory asthma[J]. Chest，2011，140(2): 401-407. DOI: 10.1378/chest.11-0221

[10] Novella L，Sanz F，Fernández-Fabrellas E，et al. Differential characteristics of patients with mild acute respiratory distress syndrome due to community-acquired pneumonia admitted to icu[J]. Chest，2014，145 (3_MeetingAbstracts): 176A. DOI: 10.1378/chest.1775773

Expression and identification of recombinant chimeric CARDS ofMycoplasmapneumoniae

LIU Bao-shan1，ZHAO Zhi-na2，ZHAO Yu-jie3,WANG Gui-zhen3

(1.ShenyangAgricultureUniversity，Shenyang110866，China;2.ShenyangPharmaceuticalUniversity，Shenyang110016，China;3.ChinaMedicalUniversity，Shenyang110013，China)

We expressed multi-epitope chimeric protein of CARDS toxin protein ofMycoplasmapneumonia(Mp) in prokaryotic cells，and purified and investigated its immunoreactivity. A recombinant multi-epitope chimeric gene including ten critical epitopes was connected by linker and cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+)，and transformed intoE.coliBL21(DE3) cells for expression under induction of IPTG. The antigenicity of expressed recombinant protein was identified with 6×His monoclonal antibody and human positive serum by Western blot. The recombinant expression vector pET-CARDS was constructed and the about 30 kDa recombinant chimeric protein expressed in BL21(DE3) successfully. Western blot analysis showed that it can react respectively with 6×His monoclonal antibodies and human positive serum. This study showed that the chimeric CARDS protein has an obvious immunoreactivity and a potential to be a new antigen for the diagnosis of Mp infection.

Mycoplasmapneumonia; CARDS toxin; chimeric; expression; identification

Wang Gui-zhen，Email: gzw004@126.com

辽宁省社会科学发展基金(No.20122225019)项目资助

王桂珍，Email:gzw004@126.com

1.沈阳农业大学，沈阳 110866； 2.沈阳药科大学，沈阳 110016； 3.中国医科大学，沈阳 110013

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.003

R375

A

1002-2694(2017)07-0588-04

2016-06-29 编辑：张智芳

Supported by the Department of Science and Technology of Liaoning Province (No. 20122225019)