肖方震，林代华，周淑姮，徐国英，邓艳琴，2



福建省鼠类感染巴尔通体调查及序列分析

肖方震1，林代华1，周淑姮1，徐国英1，邓艳琴1，2

目的 了解福建省鼠类中巴尔通体(Bartonellaspp.)的感染状况和基因特征。方法 2014-2016年采用笼日法在福建省闽东、闽西、闽南、闽北和闽中捕鼠，现场鉴定并记录捕获鼠类的釆集时间、地点、鼠种、性别、鼠龄等资料。采集鼠心脏血，PCR扩增巴尔通体的gltA和16S～23S rRNA基因，阳性PCR产物送测序并进行序列比对分析，构建系统进化树。感染率间的比较采用χ2检验或Fisher精确检验法。结果 调查共布放鼠笼5 917笼次，捕鼠381只，鼠密度为6.44%。巴尔通体感染率为12.34%。家鼠的巴尔通体感染率为10.61%，褐家鼠(Rattusnorvebicus)和黄胸鼠(Rattusflavipectus)感染率分别为11.30%和10.00%；野鼠的感染率为13.86%，黄毛鼠(Rattuslosea)和针毛鼠(Rattusfulvescens)感染率分别为22.86%和18.00%，野鼠的巴尔通体感染率高于家鼠的感染率，但无统计学意义。从地区分布看，闽西、闽北一带的感染率较高，分别为20.00%和25.33%。闽南一带感染率最低，为0。各地区感染率存在统计学意义(P<0.05)。不同性别、鼠龄的巴尔通体感染率差异无统计学意义，而不同的生境下的感染率存在统计学差异(P<0.05)。阳性样本测序分析显示，福建省鼠类感染的巴尔通体序列与B.tribocorum、B.elizabethae和B.grahamii序列最接近。结论 福建省鼠类存在巴尔通体感染，存在对人群致病的风险。

巴尔通体； 鼠类；基因特征；福建

巴尔通体(Bartonellaspp.)是一群革兰氏染色阴性菌，属于变形菌纲、α亚纲、根瘤菌目、巴尔通体科、巴尔通体属。目前至少有26个种和亚种[1]，其中超过半数与鼠类有关[2]。巴尔通体可引起人的战壕热、猫抓病、心内膜炎、菌血症和杆菌性血管瘤等疾病，尤其在免疫功能低下的人群，如HIV患者极易感染。近年由于各种巴尔通体引起的心内膜炎、菌血症等病例日益增多, 因此受到广泛的关注。目前我国的云南、内蒙古、浙江等省份陆续对鼠类感染巴尔通体开展了调查[3-5]，福建对家鼠开展过调查，但野鼠未见报道，本调查较为完整地对福建省不同地区的家鼠和野鼠开展调查，以了解福建省鼠类携带巴尔通体状况并进行基因鉴定和分析。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2014-2016年相继在福建的长乐、德化、福安、古田等11个地区捕捉家栖鼠和野鼠，调查地点涵盖了福建省的东西南北中不同地理区域，即闽东、闽西、闽南、闽北和闽中。捕鼠采用笼日法,鼠笼晚放晨收。现场鉴定鼠种,填写调查表，记录每只鼠的相关信息包括编号、釆集时间、地点、生境、鼠种、鼠龄、雌雄等。同时将捕获的鼠放入鼠袋内,经乙醚麻醉后,消毒，心脏采血。共采集了381份鼠的全血样本，置于-80 ℃保存。

1.2 DNA提取 使用血液基因组DNA提取试剂盒(厦门泰京生物技术有限公司)提取样本DNA，按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 PCR扩增 参考相关文献在gltA基因[6]和16S～23S rRNA基因间隔区(ITS)[7]分别设计一对引物。其中gltA基因设计引物为BhCS781.p:5′-GGG GAC CAG CTCATG GTG G-3′，BhCS1137.n:5′-AAT GCA AAA AGA ACA GTA AAC A-3′。在16S～23S rRNA基因间隔区设计引物为TIIe.455p:5′-GCT TGT AGC TCA GTT GGT TAG-3′，TALa.885n:5′-TGC TTG CAA AGC AGG TGC TCT-3′PCR扩增反应体系中含有Premix Taq酶12.5 μL、上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)、DNA模板3 μL，加无菌去离子水至总体积25 μL。引物BhCS781.p和BhCS1137.n 反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s、54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s、循环30次， 72 ℃总延伸5 min。引物TIIe.455P和TALa.885n 引物的条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s、55 ℃退火50 s，72 ℃延伸20 s、循环30次， 72 ℃总延伸5 min。两对引物均为阳性，判定为阳性，若仅一对引物阳性则认为阴性。首份PCR阳性标本送上海生工生物技术公司测序，经序列比对，确定为巴尔通体，其后的标本检测以此作为阳性对照。为避免发生假阳性反应，DNA模板提取、PCR反应、电泳均在不同的房间操作，同时每次反应均设有阴性对照。

1.4 产物检测 取5 μL反应产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，90 V 40 min，凝胶成像系统观察结果。采用凝胶回收试剂盒对扩增产物进行纯化，参照试剂盒说明书进行，纯化后送上海生工生物技术公司进行测序。

1.5 DNA序列分析 测序得到的DNA序列通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)进行BLAST，与相似的序列进行同源性分析。同时应用BioEdit软件对序列进行剪接，应用MEGA6.0软件以Neighbor-Joining法构建系统进化树。

1.6 统计学处理 所有数据均采用SPSS 18.0 统计软件进行处理，率的比较采用四格表χ2检验、行列表χ2检验和Fisher’s确切概率法，P<0.05表示有统计学意义。

2 结 果

2.1 调查的鼠密度以及鼠种构成 调查共布放鼠笼5 917笼次，捕鼠381只，鼠密度为6.44%(表1、表2)。闽中和闽东地区鼠密度较高，分别为8.60%和8.46%，闽南地区最低，仅为3.29%(表3)。所捕获的鼠中，家鼠179只，野鼠202只。家鼠中以褐家鼠和黄胸鼠为主，分别占64.25%和33.52%，小家鼠最少，仅占2.23%。野鼠中以黄毛鼠、板齿鼠和针毛鼠为主，分别占34.65%、22.28%和24.75%；东方田鼠所占比例最低，占0.50%。

表1 调查地区的鼠种构成及分布

Tab.1 Distribution of rodents in survey areas of Fujian Province

鼠种Speciesofrodents地区(Region)闽东EasternFujian闽西WesternFujian闽南SouthernFujian闽北NorthernFujian闽中CentralFujian总计Total褐家鼠R．norvebicus49311322115黄胸鼠R．flavipectus288024060小家鼠MusmusculusLinnaeus000404板齿鼠Bandicotaindica82003545东方田鼠MicrotusfortisBuchner000101黑线姬鼠Apodemusagrarius000202黄毛鼠R．losea103184870青毛鼠Rattusbowersilatouchei72141024社鼠Rattusconfucianus7102010针毛鼠N．fulvescens1713011950总计Total126601675104381

2.2 PCR扩增结果 引物BhCS781.p和BhCS1137.n和TIIe.455p和TALa.885n均扩增出阳性产物，阳性产物片段分别为379 bp的片段(见图1)和451 bp(图2)。阴性对照均无扩增出条带。两对引物扩增出来的结果完全一致。

M：DNA标志物；1：阳性对照；2：阴性对照； 3～9：本调查采集的鼠类血样M: DNA marker; 1: Positive control; 2: Negative control; 3-9: Blood samples of rodents collected in the survey.图1 鼠类血样巴尔通体的gltA基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of Bartonella gltA gene

M：DNA标志物；1：阴性对照；2：阳性对照； 3～9：本调查采集的鼠类血样M: DNA marker; 1: Negative control; 2: Positive control; 3-9: Blood samples of rodents collected in the survey.图2 鼠类血样16S～23S rRNA 基因的PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification of Bartonella 16S-23S rRNA ITS

2.3 不同鼠种感染巴尔通体情况 调查共检测381份鼠血，检出巴尔通体阳性的样本47份，阳性率为12.34%。其中家鼠的阳性率为10.61%，野鼠的阳性率为13.86%。两者间差异没有统计学意义(χ2=0.93，P>0.05)。家鼠中阳性率最高的为褐家鼠，感染率为11.30%，其次是黄胸鼠，感染率为10.00%。小家鼠感染率最低。野鼠中黑线姬鼠的感染率为100%，但样本量太少，不具有代表性。主要鼠种中黄毛鼠和针毛鼠感染率接近，分别为22.86%和18.00%，板齿鼠和青毛鼠的感染率为0。

表2 不同鼠种感染巴尔通体情况

Tab.2Bartonellainfection in different rodents

鼠种Speciesofrodent检测数/只No．ofexamined阳性数/只No．ofpositive阳性率%Positiverate(%)家鼠Domesticatedrodents黄胸鼠R．flavipectus60610．00小家鼠M．Linnaeus400褐家鼠R．norvebicus1151311．30合计Total1791910．61野鼠Wildrodents黑线姬鼠A．agrarius22100黄毛鼠R．losea701622．86板齿鼠B．indica4500青毛鼠R．bowersilatouchei2400社鼠R．confucianus10110．00东方田鼠M．buchner100针毛鼠N．fulvescens50918．00合计Total2022813．86总计Total3814712．34

2.4 不同地区感染巴尔通体分析 调查涵盖了福建的闽东、闽西、闽南、闽北和闽中。其中闽西、闽北一带的感染率较高，分别为20%和25.33%。闽中次之，感染率为13.46%。闽东和闽南一带感染率较低，分别为1.59%和0。各地区的差异存在统计学差异(Fisher’s确切概率法，P<0.05)。

表3 不同地区鼠形动物感染巴尔通体情况

Tab.3Bartonellainfection in rodents in different regions

地区Region布笼数No．ofcage捕获数No．ofexamined鼠密度%Densityrate%阳性数No．ofPositive阳性率%Positiverate/%闽中CentralFujian12091048．601413．46闽东EasternFujian14901268．4621．59闽西WesternFujian1216604．931220．00闽南SouthernFujian487163．2900 闽北NorthernFujian1515754．951925．33合计Total59173816．444712．34

2.5 不同性别和鼠龄感染巴尔通体分析 对不同的性别、鼠龄等可能的影响因素进行调查分析。共调查雄性鼠184只，雌性鼠197只，感染只数分别为25和22只，感染率分别为12.69%和11.96%(表4)，雌雄鼠间的感染率差异没有统计学意义(χ2=0.05，P=0.83>0.05)。以鼠龄分析，老年鼠、成年鼠和幼年鼠分别为25只、292只和64只，感染的只数分别为1、37和9只(表5)，其感染率差异没有统计学意义(χ2=1.10，P=0.29>0.05)。

表4 不同性别鼠类巴尔通体感染情况

Tab.4 Prevalence ofBartonellainfection in different rodent’s gender

性别Sex检测数(只)No．ofexamined阳性数(只)No．ofPositive阳性率(%)Positiverate/%雄性male1972512．69雌性Female1842211．96总计Total3814712．34

表5 不同鼠龄的巴尔通体感染情况

Tab.5 Prevalence ofBartonellainfection in different rodent’s age

2.6 不同生境感染巴尔通体分析 野鼠是在农田、丘陵灌丛和山坡中捕获的，农田捕获鼠类的感染率最高为38.78%，丘陵灌丛捕获的鼠类感染率最低为3.23%。由于部分家野鼠互窜，家栖的鼠类感染率为10.86%(表6)。不同生境下的感染率存在统计学差异(Fisher’s确切概率法，P<0.05)。在农田地区感染巴尔通体危险性高于其他生境。

表6 不同生境野鼠感染情况

Tab.6 Prevalence ofBartonellainfection in different rodent’s habitats

2.7 序列分析 从鼠血中扩增出的gltA基因阳性标本中随机抽取部分进行纯化和测序，并进行blast序列比对。结果显示福建省鼠类感染的巴尔通体序列与B.tribocorum、B.elizabethae和B.grahamii序列最接近。其中尤溪的巴尔通体序列与突尼斯的B.grahamii(KP126462)序列完全一致，同源性达100%。清流、长乐和顺昌的样本序列一致，该序列与法国野鼠中的B.tribocorum(AJ005494)序列高度相似，同源性达99%。永安的巴尔通体序列与台湾的B.grahamii(GU056195)序列较接近，同源为96%。而与邵武的巴尔通体序列接近的是来源于泰国的B.elizabethae(GQ225710)，同源性为95%。同时选取Genbank基因库中的序列构建进化树。树状图显示同一地点的基因型基本一致。来源于清流、长乐和顺昌的巴尔通体序列与B.tribocorum序列在同一分支，来源于邵武和尤溪的序列与B.elizabethae序列在同一分支，而来源于永安的巴尔通体的序列与B.grahamii序列处于同一分支。

图3 巴尔通体gltA基因序列的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on gltA gene of Bartonella

3 讨 论

巴尔通体病是近年我国新发的传染病之一，分布十分广泛，可以感染多种宿主动物包括猫科动物、犬科动物和偶蹄动物等，啮齿动物中的家鼠和野鼠是巴尔通体最主要的自然宿主和最大的储存宿主，野鼠的栖息地往往也是巴尔通体的自然疫源地[8-9]。鼠类对巴尔通体在自然界的长期保存、传播和流行起着重要作用。福建省山地丘陵约占陆地总面积的80%,省内分布有多个山脉，自然地理环境很适合鼠类的生存及巴尔通体的传播。

本调查采用两对引物对福建省巴尔通体感染状况进行调查，其中引物BhCS781.p和BhCS1137.n扩增gltA基因，具有属特异性，在国内外已广泛被用于巴尔通体感染的诊断和研究，而引物TIIe.455p 和TALa.885n结果两对引物扩增16S～23S rRNA基因间隔区，由于间隔区具有高度变异性，可扩增出不同大小的片段，从而区别不同种巴尔通体。选取这两对引物利于我们同其他地区的巴尔通体进行比较。两对引物扩增的结果完全一致。调查显示福建省鼠类的巴尔通体的感染率为12.34%，叶曦等曾对福建省部分地区的家鼠开展过相关调查，感染率为14.57%，与本次调查相近。但仅涉及褐家鼠和黄胸鼠[10]，鼠种局限。而与临近的省份浙江省调查的巴尔通体感染情况(4.44%)比较，福建省鼠类的感染率明显更高[5]。本次调查较为系统对福建省家鼠和野鼠展开了调查与研究。结果显示，与家鼠比较，野鼠的阳性率较高，但没有统计学意义。福建省最常见的家鼠中的褐家鼠、黄胸鼠均检出病原，野鼠中的黄毛鼠、针毛鼠等亦检出巴尔通体。但在部分常见的野鼠鼠种，包括青毛鼠和板齿鼠中未检出巴尔通体，板齿鼠和青毛鼠的分布有一定的区域性，推测与病原存在区域性有关。

B.tribocorum、B.elizabethae和B.grahamii3种鼠传巴尔通体是公认的人类致病菌，可以引起人类的心内膜炎、视神经视网膜炎以及发热等人类症状。序列分析显示福建省鼠类携带的巴尔通体序列与此3种高度相似，提示福建省鼠类存在多种巴尔通体种感染，且多对人类致病，需引起有关部门的高度重视。

对巴尔通体感染其他因素进行分析，结果显示生境对鼠类感染巴尔通体存在影响，分布于农田和山坡的野鼠，感染率远高于丘陵灌丛，而这两种生境往往是人类生产活动的主要场所，因此需要引起我们重视。而性别和鼠龄并不是鼠类感染巴尔通体的影响因素。有研究显示部分亚成年动物感染率和发病率远高于成年动物[8]，但本次调查显示幼年鼠感染率与成年鼠的感染率的差异并未有统计学意义。

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Investigation and sequence analysis onBartonellainfection in rodents in Fujian Province, China

XIAO Fang-zhen1, LIN Dai-hua1, ZHOU Shu-heng1, XU Guo-ying1, DENG Yan-qin1,2

(1.FujianPriorityLaboratoryforZoonoses,FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China;2.FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

We explored the status ofBartonellainfection in rodents and the sequence characteristics ofBartonellain Fujian Province. Rodents in Fujian Province were captured by the night trapping method during 2014-2016. Information of the captured rodents on capturing dates and geographic locations, species, gender and ages were recorded. Heart blood samples were collected, from which the fragments ofgltAgene and16S-23S rRNA gene ofBartonellawere amplified by polymerase chain reaction (PCR). The PCR products were sequenced and the phylogenetic tree was constructed for homology analysis by biological analysis software. Data on infection rate were analyzed with Chi-square or Fisher exact test to indicate statistical significance. Results showed that 5 917 cages were laid and 381 rodents were captured, density of rodent was 6.44%. The overallBartonellainfection rate in rodents was 12.34%, while infection rate in domesticated rodents was 10.61%, with 11.30% inRattusnorvebicusand 10.00% inR.flavipectus. And the infection rate in wide rodents was 13.86%, with a rate of 22.86% inRattusloseaand 18.00% inR.fulvescens, respectively. The infection rate was higher in wild rodents than in domesticated rodents, however, no significant difference was found. The Western Fujian and Northern Fujian region had the higher infection rates of 20.00% and 25.33%, and no infection was found in Southern Fujian region. The statistical analysis result revealed that a significant difference in infection rate among different region and habitats, but no significant difference in infection rate between male and female rodents, or among different ages. The BLAST results revealed the species to beB.tribocorum,B.elizabethaeandB.grahamii. In conclusion,Bartonellainfection is found in the rodents in Fujian Province and more attention should be paid on its impact on public health in the province.

Bartonella; rodent; genetic identification; Fujian

Deng Yan-qin, Email: fjcdcdyq@163.com

福建省医学创新课题(No.2012-CXB-12)和福建省自然科学基金项目(No.2017J01139)联合资助

邓艳琴，Email：fjcdcdyq@163.com

1.福建省疾病预防控制中心，福建省人兽共患病研究重点实验室，福州 350001； 2.福建医科大学，福州 350004

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.007

R37

A

1002-2694(2017)07-0607-06

2017-01-12 编辑：张智芳

Supported by the Medical Innovation Funding of Fujian Province (No. 2012-CXB-12) and the Natural Science Foundation of Fujian (No. 2017J01139)