袁小远,王晓丽，亓丽红,邵桂宾,邵桂平,杨金兴,艾 武,王永明



鸭大肠杆菌血清型分析和疫苗菌株的筛选

袁小远1,王晓丽2，亓丽红1,邵桂宾3,邵桂平3,杨金兴1,艾 武1,王永明2

目的 分析鸭大肠杆菌的血清型分布，并进行疫苗菌株的筛选。方法 近年来从山东、河北等地区的商品鸭场送检的病料中分离大肠杆菌，并进行血清型鉴定和生物特性分析；通过毒力检测和免疫原性试验筛选疫苗菌株。结果 共分离到44株鸭大肠杆菌。根据菌体抗原O进行分型，共鉴定血清型有6种：O78、O93、O76、O2、O92和O32；其中O78为优势血清型，占56.8%(25/44)；O93血清型次之，占15.9%(7/44)。免疫原性试验证实O78血清型菌株SD具有较强的毒力和良好的免疫原性。结论 分析地区的鸭场鸭大肠杆菌以 O78、O93、O76为优势血清型；免疫原性较好的SD菌株可作为下一步研制灭活疫苗的候选菌株。

鸭大肠杆菌；血清型；生物学特性；疫苗菌株

大肠杆菌病是由某些血清型大肠杆菌(E.coli)引起的原发性或继发性的细菌病，菌株在人体和动物体内广泛存在，部分致病性的大肠杆菌危害较大[1-2]。该病在卫生条件差、饲养管理不良的养殖场可造成严重的经济损失，是危害养禽业最重要的细菌性传染病之一。目前我国已分离到的禽致病性大肠杆菌血清型有很多种，各地分离的血清型也不尽相同。目前分离的常见致病性血清型是O78、O2、O76、O93和O92等。国外亦有其它一些血清型的报道，但不同发病地区的优势致病性血清型亦往往不同，从而给本病的防治增加了困难[3-4]。本文就近年来国内鸭携带的大肠杆菌进行调查并进行血清型的分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基及含0.1%微量盐溶液的马丁肉汤培养基，购自济南宝太试剂公司。

1.1.2 实验动物 7日龄和21日龄健康易感鸭，购自山东滨州某鸭场。

1.1.3 试剂 葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘露醇等细菌微量生化发酵管，购自北京陆桥生物技术有限责任公司，批号：20120412。

1.1.4 大肠杆菌O抗原因子血清 由中国兽医药品监察所提供，批号：20140706。

1.2 方法

1.2.1 调查背景 取自2015-2016年间从山东、河北、广东等5地市13个养鸭场的送检病料。对有明显临诊症状、病理剖检初步诊断为鸭大肠杆菌病的病鸭或濒死鸭的心脏、肝、脾、淋巴、输卵管等组织，共计67份样品。

1.2.2 鉴定培养 病料划线接种于麦康凯琼脂平板，37 ℃培养20～24 h。经革兰氏染色镜检初步鉴定后，挑取砖红色、表面光滑的单个菌落，接种于营养琼脂斜面上，37 ℃培养18～24 h后，置4 ℃条件下保存备用。

1.2.3 形态学观察 取麦康凯琼脂平板上砖红色、表面光滑的单个菌落涂片，革兰氏染色镜检，观察菌体形态和染色特征。

1.2.4 分离菌生化特性试验 取微量生化发酵管及各种生化培养基，将纯化培养的各菌株接入后封口，37 ℃培养24～72 h，观察结果。

1.2.5 分离株的毒力试验 将各分离菌株接种普通肉汤中，37 ℃培养24 h，进行活菌计数。将各菌株菌液分别稀释为5.0×109CFU/mL～5.0×105CFU/mL等5个不同剂量组，每个剂量组接种21日龄健康易感鸭10只，颈部皮下0.2mL/只，观察10 d，记录攻毒试验鸭发病及死亡情况。

1.2.6 分离株的免疫原性试验 鸭大肠杆菌分离株制备灭活疫苗进行免疫原性鉴定。取7日龄健康易感鸭10只，颈部皮下注射灭活疫苗0.3 mL/只，14 d后攻毒组和对照组均颈部皮下注射一个最小感染剂量(1MID)的对应制苗用强毒菌液0.2 mL/只，观察10 d，记录对照组及免疫组试验鸭免疫保护及发病情况。

2 结 果

2.1 临床症状及病理变化 通过对所有病例的观察，临床症状及病理变化总结如下：多引起局部或全身性感染，表现为败血症、心包炎、气囊炎、腹膜炎等。心包炎：此类病例较多，一般发生败血症时会引起心包炎，心包囊浑浊，心外膜水肿，并覆盖有淡黄色纤维蛋白渗出物。气囊炎：咳嗽、甩鼻、有呼噜声、肿头、肿眼、个别出现张口伸颈呼吸。腹膜炎：主要为产蛋鸭感染，其特征是急性死亡、在腹腔有纤维素渗出和破碎卵黄。

2.2 细菌分离 从67份病死鸭病料中共分离出44株鸭大肠杆菌。病料接种培养基37 ℃培养20～24 h后，普通肉汤呈均匀混浊，管底有淡白色粘稠沉淀。营养琼脂平板为中等大小、圆形微凸起、表面光滑湿润、浅灰色半透明菌落。在麦康凯琼脂平板上形成的菌落，肉眼观察为粉红色或砖红色，菌落隆起、表面光滑。

2.3 形态学和生化试验 镜检均可见两端钝圆、多数散在排列，偶尔有2～3个连在一起的革兰氏阴性杆菌。从不同地区分离的细菌能发酵葡萄糖、甘露醇、乳糖，不产生硫化氢，甲基红试验阳性，吲哚试验阳性，V.P试验阴性，不液化明胶，尿素酶试验阴性，氧化酶阴性。

2.4 血清型 44株分离株的血清型共有6种，其中O78为优势血清型。O78分离株为25株，占分离株比例的56.8%(25/44)，7株O93(15.9%)。另外还分离出5株O76、5株O2及1株O92、1株O32血清型。

2.5 毒力检测 SD菌株1.0×107CFU的剂量能够使试验鸭100%发病，并引起部分死亡，表现明显的鸭大肠杆菌病症状。剖检可见明显的大肠杆菌病病理变化(表1)。毒力试验结果表明，鸭大肠杆菌SD株能使21日龄健康易感鸭100%发病的最小感染量(MID)为1.0×107CFU，表明鸭大肠杆菌SD株具有较强毒力。

2.6 疫苗菌株的免疫原性检测 将SD株按照常规技术制备灭活苗，免疫7日龄健康易感鸭，免疫后14 d，颈部皮下注射SD株菌液，攻毒量为1.0×107CFU，观察10 d。结果：免疫鸭10/10健活，对照鸭全部发病，并有部分死亡，对照鸭剖杀后可见明显的鸭大肠杆菌病病理变化，同时可分离到血清O78型鸭大肠杆菌。所有免疫鸭全部剖杀，无肉眼可见的病理变化，未分离到鸭大肠杆菌。以上结果表明鸭大肠杆菌SD株具有良好的免疫原性。

表1 鸭大肠杆菌SD株菌种毒力试验结果

Tab.1 Virulence test results of duckE.coliSD strain

攻毒菌液菌数Numberofattackingbacteria发病鸭(只)Sickduck死亡鸭(只)Deadduck1．0×109CFU1081．0×108CFU1061．0×107CFU1051．0×106CFU621．0×105CFU30

3 讨 论

本研究通过分离培养、形态学观察、生化反应试验、血清型鉴定等，共分离出44株不同血清型的鸭大肠杆菌菌株。临床上不仅有雏鸭，而且育成鸭、肉种鸭、产蛋鸭也时有发病。由于鸭大肠杆菌病的广泛流行，对养鸭业构成比较严重的危害。另外，部分鸭大肠杆菌和人的O157血清型大肠杆菌亲缘关系较近，尤其是和人出血性E.coliO157:H7 血清型聚为一个小分支，所以从遗传进化的关系分析这些菌株有可能是人类的潜在病原[5]。

本研究分离鉴定的44株致病菌的生化反应符合鸭大肠杆菌属的特性。血清型鉴定结果表明，分离的鸭大肠杆菌菌株的血清型包括O78、O93、O76、O2、O92和O32，其中O78、O93为主。这一研究结论也和国内的一些研究报告相符[6-7]。国内外不同地区的优势血清型都有不同，耐药性差异也显著[8-10]。因此，鸭大肠杆菌的防制也需在流行病学调查的基础上适时调整。

现在大肠杆菌疫苗仍以多价或多联的灭活疫苗或亚单位疫苗为主[11-12]。为免疫防制需要，从分离的优势血清型为O78的菌株挑选出毒力相对较强、免疫原性较好的SD菌株用于下一步的灭活疫苗的制备研究，这将为鸭大肠杆菌的防控提供重要的免疫基础。

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Serotypes of duckEscherichiacoliand strain selection for vaccine

YUAN Xiao-yuan1，WANG Xiao-li2，QI Li-hong1，SHAO Gui-bin3， SHAO Gui-ping3，YANG Jin-xing1，AI Wu1，WANG Yong-ming2

(1.InstituteofPoultryResearch，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Ji’nan250023，China;2.ShandongHuahongBiologicalEngineeringCo.，Ltd.，Binzhou256600，China;3.ShandongLvxianZhongxinAgricultureandAnimalHusbandryCo.，Ltd.，Rizhao276500，China)

In order to obtain the serotype distribution ofE.colifrom duck and to screen the vaccine bacterial strains，the serotype identifications and biological characteristics ofE.coliwere analyzed in recent years from Shandong，Hebei and other areas of commercial duck field; selections of vaccine strains were detected by the virulence and immunogenicity. Totally 44 isolated bacterial strains ofE.colifrom duck were identified to a total of six serotypes: O78，O93，O76，O2，O92 and O32. The O78 serotype was the dominant serotype，accounting for 56.8% (25/44); O93 serotype for 15.9% (7/44) according to bacterial O-antigen typing. The strain SD (O78 serotype) was confirmed to have strong virulence and good immunogenicity. The O78，O93 and O76 are the dominant serotypes of duckE.coliin the study areas. The SD strain could be used as the candidate for the next development of inactivated vaccine.

duckEscherichiacoli; serotype; biological characteristic; vaccine strain

s: Ai Wu，Email: 767068849@qq.com.cn；Wang Yong-ming，Email: wym197972@163.com

山东省自然科学基金项目(No.ZR2015CM009)、科技基础性工作专项(No.2012FY111000)、山东省2015年度农业重大应用技术创新项目和山东省农业科学院院青年基金项目(No.2014QNM15、No.2015YQN61、No.2016YQN56)联合资助

艾 武，Email：767068849@qq.com.cn； 王永明， Email：wym197972@163.com

1.山东省农业科学院家禽研究所，济南 250023； 2.山东华宏生物工程有限公司，滨州 256600； 3.山东莒县众鑫农牧有限公司，日照 276500

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.006

R378.2

A

1002-2694(2017)07-0604-03

2016-07-20 编辑：张智芳

Supported by the Shandong Provincial Natural Science Foundation (No.ZR2015CM009)，the National Science and Technology Special Fund of China (No.2012FY111000)，the Shandong Innovation Project of Agricultural Major Application Technology(2015)，and the Youth Scientific Research Foundation of Shandong Academy of Agricultural Sciences (Nos.2014QNM15，2015YQN61，2016YQN56)