巫水珍, 魏海霞, 程鑫宇，戎 可，彭鸿娟



应用改良凝集试验(MAT)法检测东北地区野生鸟类弓形虫感染的血清学调查

巫水珍1, 魏海霞1, 程鑫宇1，戎 可2，彭鸿娟1

目的 了解中国东北地区野生鸟类的弓形虫感染情况。方法 在对东北地区野生鸟类进行调查时，从翼根静脉采集约500 μL全血，凝血后分别分离出血清，采用改良凝集试验(MAT)方法检测血清中弓形虫抗体的阳性率。结果 共收集到179份野生鸟类血清样本，其中弓形虫阳性血清样本20份，总的血清阳性率约为11.17%。179只野生鸟隶属于9目17科31种，其中鸽形目、雀形目、隼形目、鴷形目、佛法僧目、雁形目的血清阳性率分别为5.26%(1/19)，9.09%(9/99)，14.29%(3/21)，15.00%(5/22)，16.67%(1/6)，和25.00%(1/4)。按不同食性分类，肉食性、杂食性或水生动植物为食的鸟类的血清阳性率分别为12.00%(3/25)，10.60%(15/141)，15.38%(2/13)。按照鸟类是否迁徙分类，候鸟和留鸟的血清阳性率分别为11.67%(14/120)，10.71%(6/59)。结论 东北地区的野生鸟类中弓形虫抗体的阳性率约为11.17%，显示弓形虫感染现象常见于野生鸟类。

野生鸟类；弓形虫；改良凝集试验

刚地弓形虫 (Toxoplasmagondii)是一种全球性分布的人兽共患的专性细胞内寄生原虫，其宿主范围极其广泛，包括鸟类、人和其他温血动物[1-2]。目前，国外和国内部分地区已有关于野生鸟类弓形虫血清阳性率的报道。巴西调查结果显示Abrolhos群岛海鸟弓形虫血清阳性率34.80%[3]；西班牙调查结果显示野生鸟类阳性率为26.10%，雕鸮等个别物种的阳性率高达60%以上[4]；台湾岛野生鸟类的血清阳性率为23.35%[5]；北京地区被救护的鸟类血清阳性率为27.48%[6]。这些调查结果说明鸟类是弓形虫的重要中间宿主，这不仅对鸟类自身种群造成潜在威胁，而且可能会传播给家养动物和人类，给畜禽养殖业和人类的健康带来较大的危害。同时，野生鸟类会进行全球性的迁徙，将病原体传播到其他地区。野生鸟类弓形虫感染的血清学情况也是评价环境被弓形虫卵囊污染的指标[7-8]。因此需要重视和加强监测和研究。黑龙江尚志市帽儿山属于长白山支脉，张广才岭西北部小岭的余脉，森林资源丰富，是东北地区野生鸟类重要的繁殖地，同时，也是黑龙江省以北广大地区繁殖鸟类南迁越冬途经地和越冬地。本次调查以黑龙江省尚志市帽儿山农场为研究地点，以野生鸟类为研究对象，采用改良凝集试验(Modified agglutination test，MAT)检测黑龙江地区野生鸟类弓形虫感染情况。

1 材料和方法

1.1 血清样本 野生鸟类的血清样本，于2016年4月到10月，采自黑龙江省尚志市帽儿山农林。试验所涉及的鸟类均来自野外。根据鸟的体型大小决定采血量，翼下静脉采血，每只鸟至少0.5 mL，装于EP管中，迅速送到实验室。3 000 r/min离心10 min吸取上清，置于-20 ℃冰箱保存备用。采血后的鸟类已经全部放归野外。人工感染的弓形虫IgG阳性的小鼠血清(本实验室保存)作为阳性对照，未感染弓形虫小鼠血清作为阴性对照。

1.2 抗原制备 MAT抗原按照文献方法制备[9]。用HFF细胞培养弓形虫速殖子，细胞裂解后小心收集上清，2 000 r/min离心10 min后，6%福尔马林固定过夜。固定后2 000 r/min离心10 min，最后以2.2×106个/mL重悬在抗原碱性缓冲液[7.02 g NaCl、3.09 g boric acid (H3BO3)、24 mL 1M NaOH、4 g bovine plasma albumin稀释于1 L双蒸水，pH 8.3-8.4]中，经验证可用后置于4 ℃保存备用。

1.3 MAT血清学检测 在96孔U型血凝板上加入25 μL从1∶25倍比稀释至1∶200的血清，之后每孔加入25 μL充分混匀的抗原稀释液(内含1.56 μL抗原，0.36 μL二巯基乙醇，0.52 μL伊文思蓝，并用抗原碱性缓冲液补足)。摇匀后，盖上封口膜，置于37 ℃温箱中过夜，次日判定结果。被检样品血清滴度达到1∶25即判定为阳性。每次试验均设定阳性和阴性对照。

2 结 果

本实验室制备的MAT抗原检测弓形虫感染的模型小鼠血清和未感染的空白小鼠血清，感染小鼠的阳性滴度至少为1∶12 800，空白小鼠均为阴性。试验重复3次，结果一致，故本实验室制备的MAT抗原特异性及灵敏性较好, 后续可以使用该抗原检测野生鸟类血清中弓形虫抗体，判定野生鸟类的弓形虫感染情况。

本次调查共采集了黑龙江地区179只野生鸟类的179份全血标本，这些鸟隶属于9目17科31种，各种鸟的弓形虫血清抗体的检测结果见表1。不同目的野生鸟类的血清阳性率不同，雀形目为9.09%(9/99)，鸽形目为5.26%(1/19)，鴷形目为15.00%(5/22)，佛法僧目为16.67%(1/6)，隼形目为14.29%(3/21)，雁形目为25.00%(1/4)，由于样本量少，其它目的野鸟的血清均为阴性。总体来看，179只鸟中弓形虫血清阳性者共20只，阳性率为11.17%。本实验重复3次，结果基本一致。

表1 2016年东北地区野生鸟类弓形虫血清学检测结果

Tab.1 Seroprevalence ofT.gondiiin wild birds in northeast China in 2016

目Order科Family种Species样本数No．oftested样本数No．ofpositive阳性率Seropositivity雀形目Passeriformes9999．09鸫科Turdidae50612．00白腹鸫Turduspallidus19315．79红尾鸫Turdusnaumanni1700．00灰背鸫Turdushortulorum13323．08红喉歌鸲Lusciniacalliope100．00鹟科Muscicapidae6233．33白眉地鸫Zootherasibirica3133．33红胁蓝尾鸲Tarsigercyanurus11100．00虎斑地鸫Zootheradauma200．00鹡鸰科Motacillidae3133．33白鹡鸰Motacillaalba200．00灰鹡鸰Motacillacinerea11100．00鹀科Emberizidae200．00黄喉鵐Emberizaelegans100．00灰头鵐Black⁃facedBunting100．00鸦科Corvidae2600．00灰喜鹊Cyanopicacyana1700．00松鸦Garrulusglandarius900．00伯劳科Laniidae800．00红尾伯劳Laniuscristatus800．00雀科Paridae200．00燕雀Fringillamontifringilla200．00山椒鸟科Campephagidae100．00灰山椒鸟Pericrocotusdivaricatus100．00鳾科Sittidae100．00普通鳾Sittaeuropaea100．00鸽形Columbiformes1915．26鸠科Columbidae1915．26斑鸠Streptopelia1815．56山斑鸠Streptopeliaorientalis100．00夜鹰目Caprimulgiformes100．00夜鹰科Caprimulgidae100．00普通夜鹰Caprimulgusindicus100．00鴷形目Piciformes22515．00啄木鸟科Picidae22515．00绿啄木鸟Picusawokera9222．22白背啄木鸟Dendrocoposleucotos8112．50大斑啄木鸟Dendrocoposmajor2150．00小斑啄木鸟Dendrocoposminor3133．33续表

目Order科Family种Species样本数No．oftested样本数No．ofpositive阳性率Seropositivity鸻形Charadriiformes300．00鹬科Scolopacidae300．00白腰草鹬Tringaochropus200．00丘鹬Scolopaxrusticola100．00佛法僧Coraciiformes6116．67翠鸟科Alcedinidae6116．67普通翠鸟Alcedoatthis6116．67雁形目Anseriformes4125．00鸭科Anatidae4125．00绿头鸭Anasplatyrhynchos4125．00隼形目Falconiformes21314．29鹰科Accipitridae21314．29日本松雀鹰Accipitergularis18316．67雀鹰Accipiternisus300．00鸮形目Strigiformes400．00鸱鸮科Strigidae400．00普通角鸮Otusscops400．00

2.1 不同觅食方式的野生鸟类的弓形虫血清阳性率 将179只野生鸟类按照食性的不同分为3类：肉食性，杂食性，水生动植物为食类。根据野生鸟类的不同的食性进行统计学分析。野生鸟类的食性不同，弓形虫血清阳性率也有所不同，水生动植物为食类最高(约15.38%)，肉食性居中(约12.00%)杂食性最低(约10.60%)(表2)。用Fisher 确切概率法分析，结果表明不同食性组间阳性率没有显著性差异(P>0.05)。

表2 不同食性的野生鸟类的弓形虫血清学检测结果

Tab.2 Seroprevalence ofT.gondiiin wild birds with different feeding behaviors

血清数No．ofsample阳性血清数No．ofpositive阳性率/%Seropositivity%肉食性carnivorousbirds25312．00杂食性omnivorousbirds1411510．60水生动植物为食birdsfeedingonaquaticanimalsorplants13215．38总计total1792011．17

2.2 不同迁徙习性的野生鸟类的弓形虫血清阳性率 根据鸟类是否迁徙将鸟分为候鸟和留鸟。根据鸟类迁徙习性的不同进行统计学分析。候鸟的血清阳性率(约11.67%)比留鸟(约10.71%)的阳性率高(表3)。用卡方检验分析，结果表明，两者无统计学差异(P>0.05)。

表3 迁徙习性不同的野生鸟类的弓形虫血清学检测结果

Tab.3 Seroprevalence ofT.gondiiin wild birds with different migratory habit behaviors

血清数No．ofsample阳性血清数No．ofpositive阳性率/%Seropositivity%候鸟migratorybirds1201411．67留鸟sedentary(non⁃migratory)birds59610．71

3 讨 论

本次调查运用改良凝集试验(MAT)技术对黑龙江地区野生鸟类进行弓形虫感染的血清学调查。该技术有高的特异性和灵敏性[10]，且已经广泛运用在哺乳动物和鸟类弓形虫感染的血清学调查[4, 11-13]。该方法所需的试剂和仪器设备易得，操作简单，安全性高，故选用该方法进行调查。

本次调查是首次对黑龙江地区野生鸟类进行弓形虫感染的血清学调查，结果显示，黑龙江地区野生鸟类弓形虫感染较为普遍。不同食性和不同迁徙习性的野生鸟类的弓形虫血清阳性率略不同，如肉食性野生鸟类的阳性率比杂食性野生鸟类的阳性率高，虽然差异没有统计学意义，但可以看出大体的趋势。这和现有的文献报道相符合，野生鸟类的食性和弓形虫的感染密切相关，肉食性鸟类的阳性率高于杂食性鸟类[4-5]。肉食性野生鸟主要捕食啮齿类动物、小的哺乳动物和其他鸟类，这些动物都是弓形虫的中间宿主。肉食性鸟类积累性的捕食这些可能含弓形虫的动物而受到感染。这个结果也与哺乳动物的调查结果相似，肉食性动物的弓形虫血清阳性率比杂食性、食草和食虫的动物都高[14-15]。因此，肉食性动物在弓形虫的流行中具有重要的意义。

地面觅食的野生鸟类弓形虫感染的血清学情况是评价土壤被弓形虫卵囊污染的指标[7-8]，地面觅食的鸟类大部分是杂食性鸟类。弓形虫的感染率和当地猫科动物有联系，东北地区存在较多的家猫和野猫[16-17]，虽然目前还没有关于该地区猫和野生猫科动物弓形虫感染情况的报道，但从该地区其他动物(如马、牛、北极狐及梅花鹿等动物)的弓形虫感染情况[18-21]，可推断该地区的土壤中存在弓形虫卵囊污染，这些鸟类通过摄入被猫粪便中弓形虫卵囊污染的食物和水而感染，应加强防控弓形虫卵囊感染土壤的意识。

有趣的是，本次调查中以水生动植物为食的鸟类的弓形虫血清阳性率最高。其原因可能是这些野生鸟类食入含有弓形虫的小动物而被感染。其次，可能该地区的水环境被猫粪便中的弓形虫卵囊污染，且水边的环境有利于卵囊的生存和传播[2]，弓形虫的卵囊在水中至少可以存活6个月[22]。冷血动物包括鱼、贝类虽不是弓形虫的宿主，但可作为弓形虫传播的载体从而浓缩水中弓形虫卵囊[23-24]，因此水生动植物为食的鸟类的阳性率较高。同时，本研究中以水生动植物为食野生鸟类的弓形虫血清感染率与朱兴全等[25]发现的东北地区的野生水禽弓形虫感染情况基本一致。当然，不管是肉食性，杂食性或者水生动植物为食的野生鸟类都有可能通过垂直传播而感染弓形虫。

本研究中候鸟的血清阳性率高于留鸟，虽然两者的阳性率差异没有统计学意义，但候鸟类对于弓形虫的传播有更重要的意义，因为被感染的候鸟常在我国广大的地区活动，扩大弓形虫传播的范围。

总的来说，本次调查结果表明东北地区的许多野生鸟类广泛暴露于弓形虫，具有较高的血清阳性率。初步调查的数据可以为将来持续性的血清学监测提供重要的数据支持。本实验由于部分样本的样本量较小，后期分析感染的影响因素存在一定的局限性。

[1] Dubey JP. A review of toxoplasmosis in wild birds[J]. Vet Parasitol, 2002, 106(2): 121-153.

[2] Wang M, Ye Q, Zhang NZ, et al. Seroprevalence ofToxoplasmagondiiinfection in food-producing animals in Northweast China[J]. Chin J Zoonoses, 2016, 32(7): 608-612. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.004 (in Chinese)

王萌，叶强，张念章，等. 中国西北地区肉用动物弓形虫血清学调查[J]. 中国人兽共患病学报, 2016, 32(7): 608-612.

[3] Gennari SM, Niemeyer C, Soares HS, et al. Seroprevalence ofToxoplasmagondiiin seabirds from Abrolhos Archipelago, Brazil[J]. Vet Parasitol, 2016, 226: 50-52. DOI: 10.1016/j.vetpar.2016.06.016

[4] Oscar CN, Ignacio GAB, Rafael MLP, et al. Seropositivity and risk factors associated withToxoplasmagondiiInfection in wild birds from Spain[J]. PLoS One, 2011, 6(12). DOI: 10.1371/journal.pone.0029549

[5] Chen J, Tsai Y, Wu Y. Seroprevalence ofToxoplasmagondiiantibodies in wild birds in Taiwan[J]. Res Vet Sci, 2015, 102: 184-188. DOI: 10.1016/j.rvsc.2015.08.010

[6] Hu CM, Wang BB, Sun XN, et al. Seroprevalence ofToxoplasmagondiiin wild birds rescued in Beijing, China[J]. Chin J Vet Med, 2014, 50(02): 14-16. DOI: 10.3969/j.issn.0529-6005.2014.02.004 (in Chinese)

胡春梅，王贝贝，孙翔楠，等. 北京地区被救护的野生鸟类弓形虫感染的血清学调查[J]. 中国兽医杂志, 2014, 50(02): 14-16.

[7] Frenkel JK, Hassanein KM, Hassanein RS, et al. Transmission ofToxoplasmagondiiin Panama City, Panama: a five-year prospective cohort study of children, cats, rodents, birds, and soil[J]. Am J Trop Med Hyg, 1995, 53(5): 458-468. DOI: 10.4269/ajtmh.1995.53.458

[8] Ruiz A, Frenkel JK. Intermediate and transport hosts ofToxoplasmagondiiin Costa Rica[J]. Am J Trop Med Hyg, 1980, 29(6): 1161-1166. DOI: 10.4269/ajtmh.1980.29.1161

[9] Dubey JP, Desmonts G. Serological responses of equids fedToxoplasmagondiioocysts[J]. Equine Vet J, 1987, 19(4): 337-339. DOI: 10.1111/j.2042-3306.1987.tb01426.x

[10] Dubey JP, Laurin E, Kwowk OCH. Validation of the modified agglutination test for the detection ofToxoplasmagondiiin free-range chickens by using cat and mouse bioassay[J]. Parasitology, 2016, 143(03): 314-319. DOI: 10.1017/S0031182015001316

[11] Gennari SM, Ogrzewalska M, Soares HS, et al. Occurrence ofToxoplasmagondiiantibodies in birds from the Atlantic Forest, state of São Paulo, Brazil[J]. Vet Parasitol, 2014, 200(1/2): 193-197. DOI: 10.1016/j.vetpar.2013.10.003

[12] Dubey JP, Ness SL, Kwok OC, et al. Seropositivity ofToxoplasmagondiiin domestic donkeys (Equusasinus) and isolation ofT.gondiifrom farm cats[J]. Vet Parasitol, 2014, 199(1/2): 18-23. DOI: 10.1016/j.vetpar.2013.09.027

[13] Feng YJ, Wang YH, Yang YR. Seroprevalence and risk factors of sheep in neosporosis and toxoplasmosis[J]. Chin J Zoonoses, 2016, 32(7): 613-617. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.005 (in Chinese)

冯永杰，王英华，杨玉荣. 绵羊新孢子虫病和弓形虫病血清流行病学调查及风险因素分析[J]. 中国人兽共患病学报, 2016, 32(7): 613-617.

[14] Smith DD, Frenkel JK. Prevalence of antibodies toToxoplasmagondiiin wild mammals of Missouri and east central Kansas: biologic and ecologic considerations of transmission[J]. J Wildl Dis, 1995, 31(1): 15-21. DOI: 10.7589/0090-3558-31.1.15

[15] Wang DW, Han XH, Mu MY, et, al. Epidemiological survey of toxoplasmasis in some animals from northeastern China[J]. Heilongjiang Animal Sci Vet Med, 2014(23): 129-131. DOI: 10.13881/j.cnki.hljxmsy.2014.1435 (in Chinese)

王大为，韩小虎，慕名扬，等. 中国东北地区部分动物弓形虫病的流行病学调查[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2014(23): 129-131.

[16] Meng Q, You H, Zhou N, et al. Seroprevalence ofToxoplasmagondiiantibodies and associated risk factors among children in Shandong and Jilin provinces, China[J]. Int J Infect Dis, 2015, 30: 33-35. DOI: 10.1016/j.ijid.2014.11.002

[17] Sun L, Zhou P, He S, et al. Sparse serological evidence of H5N1 avian influenza virus infections in domestic cats, northeastern China[J]. Microb Pathog, 2015, 82: 27-30. DOI: 10.1016/j.micpath.2015.03.003

[18] Yang N, Mu MY, Yuan GM, et al. Seroprevalence ofToxoplasmagondiiin slaughtered horses and donkeys in Liaoning province, northeastern China[J]. Parasit Vectors, 2013, 6(140): 579-582. DOI: 10.1186/1756-3305-6-140

[19] Qiu J, Wang C, Zhang X, et al. Seroprevalence ofToxoplasmagondiiin beef cattle and dairy cattle in northeast China[J]. Foodborne Pathog Dis, 2012, 9(7): 579-582. DOI: 10.1089/fpd.2011.1104

[20] Zhang X, Cong W, Ma J, et al. First genetic characterization ofToxoplasmagondiiinfection in Arctic foxes (Vulpeslagopus) in China[J]. Infect Genet Evol, 2016, 44: 127-129. DOI: 10.1016/j.meegid.2016.06.042

[21] Qin SY, Zhang XX, Cong W, et al. Seroprevalence and risk factors ofToxoplasmagondiiinfection in domestic sika deer (Cervusnippon) in northeastern China[J]. Acta Trop, 2014, 140: 184-187. DOI: 10.1016/j.actatropica.2014.08.021

[22] Lindsay DS, Collins MV, Mitchell SM, et al. Sporulation and survival ofToxoplasmagondiioocysts in seawater[J]. J Eukaryot Microbiol, 2003, 50 Suppl: 687-688. DOI: 10.1111/j.1550-7408.2003.tb00688.x

[23] Lindsay DS, Collins MV, Mitchell SM, et al. Survival ofToxoplasmagondiioocysts Eastern oysters (Crassostreavirginica)[J]. J Parasitol, 2004, 5(90): 1054-1057. DOI: 10.1645/GE-296R

[24] Arkush KD, Miller MA, Leutenegger CM, et al. Molecular and bioassay-based detection ofToxoplasmagondiioocyst uptake by mussels (Mytilusgalloprovincialis)[J]. Int J Parasitol, 2003, 33(10): 1087-1097. DOI: 10.1016/S0020-7519(03)00181-4

[25] Zhang F, Wang H, Qin S, et al. Molecular detection and genotypic characterization ofToxoplasmagondiiin wild waterfowls in Jilin Province, Northeastern China[J]. Parasitol Int, 2015, 64(6): 576-578. DOI: 10.1016/j.parint.2015.08.008

Seroprevalence ofToxoplasmagondiiin wild birds in Northeast China by modified agglutination test

WU Shui-zhen1, WEI Hai-xia1, CHENG Xin-yu1, RONG Ke2, PENG Hong-Juan1

(1.DepartmentofPathogenBiology,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofTropicalDiseaseResearch,andKeyLaboratoryofPreventionandControlforEmergingInfectiousDiseasesofGuangdongHigherInstitutes,SchoolofPublicHealth,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2.DepartmentofWildlifeResources,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China)

We detected the seroprevalence ofToxoplasmagondii(T.gondii) in the wild birds in northeast China. The wild bird’s blood was collected from the cutaneous ulnar vein and the serum was isolated and used for detection of antiT.gondiiantibody by modified agglutination test (MAT). Results showed that totally 179 birds’ serum samples were collected. Twenty serum samples (11.17%) were positive withT.gondiiantibody, which belonged to 9 orders, 17 families and 31 species. The seroprevalence againstT.gondiiwas about 5.26% (1/19) in Columbiformes, 9.09% (9/99) in Passeriformes, 14.29% (3/21) in Falconiformes, 15.00% (5/22) in Piciformes, 16.67% (1/6) in Coraciiformes, and 25.00% (1/4) in Anseriformes. Based on their feeding behavior, the seroprevalence was 12.00% (3/25) in carnivorous wild birds, 10.60% (15/141) in omnivorous wild birds, and 15.38% (2/13) in the wild birds feeding on aquatic animals or plants. These wild birds also can be sorted as migratory and sedentary (non-migratory) according to their migration habits, and the serum positivity was 11.67% (14/120), and 10.71% (6/59) respectively. The seroprevalence againstToxoplasmagondiiin wild birds in northeast China is about 11.17%, which indicates a common infection ofToxoplasmagondiiin wild birds.

wild birds;Toxoplasmagondii; MAT

s: Rong Ke, Email: 150040rongke@nefu.edu.cn; Peng Hong-Juan, Email: hongjuan@smu.edu.cn

国家自然科学基金面上项目(No. 81271866,No.81572012), 广东省高校珠江学者特聘教授基金(No.2014), 广东省自然科学基金重点项目(No.2016A030311025)和南方医科大学2015年省级大学生创新训练计划项目(No.201512121121)联合资助

戎 可,Email:150040rongke@nefu.edu.cn 彭鸿娟,Email:hongjuan@smu.edu.cn

1.南方医科大学公共卫生学院病原生物学系，广东省热带病研究重点实验室，广东省普通高校新发传染病防治重点实验室, 广州 510515； 2.东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨 150040

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.016

R382.5

A

1002-2694(2017)07-0658-06

2017-01-23 编辑：张智芳

Supported by the funding of the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81271866 and 81572012), the Guangdong Province Universities and Colleges Pearl River Scholar Funded Scheme (2014), the Guangdong Provincial Natural Science Foundation Key Project (No. 2016A030311025), and the Southern Medical University 2015 Undergraduate Student Innovation Training Program (No. 201512121121)