纪 蕾，吴晓芳，陈莉萍，韩建康



一起急性腹泻疫情中检出的GI.8型诺如病毒的序列测定和分子特征分析

纪 蕾，吴晓芳，陈莉萍，韩建康

目的 对湖州地区一起急性腹泻疫情中检出的GI.8型诺如病毒进行序列测定和分子特征分析。方法 根据GI型诺如病毒保守序列自行设计5对引物，用一步法RT-PCR分段扩增GI.8型诺如病毒CHN/Huzhou/N10的全基因组序列，采用生物信息学相关软件对序列进行整理和分析。结果 CHN/Huzhou/N10全长7 740 bp，编码区包括3个开放读码框架(ORF1～ORF3)，分别长5 400 bp(5～5 404 nt)、 1 632 bp(5 388～7 019 nt)和642 bp(7 019～7 660 nt)。RdRp区，VP1区和VP2区的系统进化分析显示CHN/Huzhou/N10属于GI.8基因型。衣壳蛋白区的氨基酸序列分析表明，与原型株Boxer/2001/US相比，CHN/Huzhou/N10 VP1区的氨基酸序列共有16个变异位点，12个位于P2区。其中aa347T→S，aa397T→E这2个变异位点分别位于HBGA受体结合袋位点II和III内。结论 本文获得了我国GI.8型诺如病毒CHN/Huzhou/N10的全基因组序列，相关序列信息可用于病毒的遗传进化研究、快速诊断试剂的研发以及疫苗的设计。

诺如病毒；GI.8；全基因组

急性腹泻是世界上最常见的疾病之一，也是全球主要的公共卫生问题之一。自从敏感的分子检测技术的应用以来，诺如病毒(Norovirus，NoV)已被公认为是发达国家和发展中国家急性病毒性腹泻的重要病原。该病毒常可通过污染的水源和食物引起急性胃肠炎的流行，各年龄人群普遍易感。根据病毒主要衣壳蛋白VP1的核苷酸序列差异，NoV可分为6个基因群(gene group I～VI，GI～GVI)，其中可以引起人类感染包括基因群GI、GII和GIV[1]。在引起急性胃肠炎流行的NoV中，GII型NoV一直处于优势地位，其中GII.4型是流行的主要基因型别。因此目前国内外有关GII型NoV的分子流行病学研究相对较多，而GI型NoV的序列研究相对较少。湖州地区2008-2009年2起由GI型NoV引起的急性腹泻疫情中均检出了GI.8型NoV[2]，我们对检出的其中一株GI.8型NoV进行测序，以了解其基因结构和遗传特征。

1 材料与方法

1.1 标本信息 湖州地区2008年4月某学校一起NoV引起的急性腹泻疫情中采集的学生粪便标本。该份标本经RT-PCR检测显示GI型NoV核酸阳性，RT-PCR引物探针参照文献[3]，部分衣壳蛋白序列分析显示为GI.8型NoV[2]。

1.2 病毒核酸提取和基因组扩增 病毒核酸提取采用罗氏公司High Pure Viral RNA Kit。取粪便加入无菌磷酸盐缓冲液制成15%悬液。混匀后4 500 r/min离心8 min，取200 μL上清参照试剂盒说明书提取核酸。利用5对引物扩增病毒的全基因组序列，其中 9条为参照GenBank上下载的GI型NoV全基因组序列保守区自行设计的引物， 1条用于扩增病毒3′末端的下游引物TX30SXN5则参照已发表文献[4]。引物序列具体见表1，引物位置参照毒株NV68 (M87661)。采用大连宝生物公司的PrimeScript OneStep RT-PCR kit进行序列的扩增。反应条件为：50 ℃ 30 min；94 ℃ 1.5 min； 94 ℃ 45 s、55 ℃ 35 s、72 ℃ 2 min，40次循环；72 ℃延伸10 min(其中F1和R1扩增延伸3.5 min，F4和R4扩增延伸1mim)。PCR扩增阳性产物送南京金斯瑞公司进行纯化测序。

表1 NoV全基因组扩增引物

Tab.1 Primers used for the full-length genome amplification

引物名称Primer方向Polarity序列(5′⁃3′)Sequences(5′⁃3′)位置PositionF1+GTGAATGATGATGGCGTCGAAA1⁃22R1-GAGGTAGGGGTTGTGGGGTTGA3629⁃3650F2+GGNGAAACHGAAATGGAAATCCG3104⁃3126R2-CTGGGTCAAAWTCTATGTCAGTMGA4886⁃4910F3+GGAAGAATGATGATTGGAATGGCAC4221⁃4245R3-CGTCCTTAGACGCCATCATCATTTA5356⁃5379F4+TAGTCAGGCAACAGGTGGAT4983⁃5002R4-TGGTAAAGGTTCAGCCGTAT5432⁃5455F5+AAATGATGATGGCGTCTAAGGACG5356⁃5379TX30SXN5-GACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTPolyA

1.3 序列的遗传进化分析 利用DNAStar的SeqMan软件包和MegAlign软件包对测序结果进行整理及序列的同源性分析。应用MEGA6.0 软件采用N-J模型进行系统进化分析并构建系统进化树。

2 结 果

2.1 病毒基因组结构特征 GI.8型NoV湖州株CHN/Huzhou/N10的基因组全长7 740 bp，编码区包括3个开放读码框架(Open reading frames，ORF)。ORF1长5 400 bp(5～5 404 nt)，编码包含RNA依赖的RNA多聚酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)在内的病毒非结构蛋白；ORF2长1 632 bp(5 388～7 019 nt)， ORF3长642 bp(7 019～7 660 nt)，分别编码病毒的主要衣壳蛋白VP1和小衣壳蛋白VP2。CHN/Huzhou/N10的序列已上传GenBank，登录号为KP407450。

2.2 系统进化分析 从GenBank上下载GI.I～GI.9基因型NoV代表株的序列进行同源比对和分析。核苷酸序列的同源性分析显示CHN/Huzhou/N10在RdRp区(4 593～5 404 bp)、VP1区(5 388 bp～7 019 bp)和VP2区(7 019 bp～7 660 bp)均与GI.8型代表株的同源性最高(92.8%～99.6%)。分别构建RdRp区，VP1区和VP2区的系统进化树，结果见图1。CHN/Huzhou/N10在各区均与GI.8基因型代表株聚为一簇，属于GI.8基因型，以上结果表明CHN/Huzhou/N10未发生重组。用于序列比对分析的GI型NoV各基因型代表株分别为GI.1_M87661，GI.2_L07418，GI.3_U04469，GI.4_AB042808，GI.5_AB039774，GI.6 _AF093797，GI.7_JN603251(RdRp区)，GI.7_AJ277609(VP1区)，GI.7_ JN899243(VP2区)，GI.8_GU299761(RdRp区)，GI.8_AF538079(VP1区和VP2区)，GI.9_HQ637267。

2.3 衣壳蛋白VP1区的序列分析 CHN/Huzhou/N10 VP1区全长1 629 bp，编码543个氨基酸。GenBank数据库上下载已有的GI.8型NoV的VP1全序列，包括GI.8型原型株Boxer/2001/US、Beijing/53671/2007/、JP/2007/Nagoya/KY531和2008890321/2008/US。CHN/Huzhou/N10与原型株Boxer/2001/US衣壳蛋白区的氨基酸同源性为96.9%，与其他3株的氨基酸同源性为99.4%～99.6%。与原型株Boxer/2001/US相比，CHN/Huzhou/N10 VP1区的氨基酸序列共有16个变异位点,其中12个位于P2区，占8.5%。在其他区域，变异位点的数量和比例要小的多，分别为N端2个，占4.1%；S区1个，占0.6%；P1区1个，占0.6%，具体见表3。除了第357位的aa357H→R为CHN/Huzhou/N10所特有，其余11个位于P2区的变异位点为Beijing/53671/2007/、JP/2007/Nagoya/KY531、2008890321/2008/US和CHN/Huzhou/N10所共有，见图2。其中aa347T→S，aa397T→E 这2个变异位点分别位于人外周血组织抗原(HBGA)结合位点II和III[5]。

表2 CHN/Huzhou/N10 RdRp、VP1、VP2区的核苷酸序列同源性分析(%)

Tab.2 Nucleotide identity of RdRp，VP1，and VP2 region between2008/Huzhou/N11 and the representatives of GI.1-GI.9 genotypes(%)

GI．IGI．2GI．3GI．4GI．5GI．6GI．7GI．8GI．9RdRp75．776．682．374．075．576．179．199．678．8VP164．564．570．662．963．864．266．792．868．7VP258．556．947．854．756．559．461．893．770．1

A. RdRp 区B. VP1区 C. VP2区图1 CHN/Huzhou/N10 RdRp区、VP1区、VP2区序列系统进化分析Fig.1 Phylogenetic analyses based on partial RdRp gene(A)， complete VP1 gene (B) and VP2 gene (C)

表3 NoV湖州株CHN/Huzhou/N10衣壳蛋白区氨基酸水平变异位点分析

Tab.3 Variation sites in the capsid protein VP1 of CHN/Huzhou/N10

区域Domainaa位置aapositionaa长度Totallength(aa)变异位点所占比例No．(%)ofinformativeaaN1⁃49492(4．1)S50⁃2191701(0．6)P1227⁃279，420⁃5431771(0．6)P2280⁃41914012(8．5)

图2 NoV湖州株CHN/Huzhou/N10衣壳蛋白P2区的变异位点分析Fig.2 Variation sites in the capsid protein P2 region of CHN/Huzhou/N10

3 讨 论

NoV基因型别众多，根据病毒VP1区的核苷酸序列差异，GI型NoV可进一步分为9个基因型(GI.1～GI.9)，其中Boxer/2001/US是GI.8型的原型参考株[6]。此外，作为RNA病毒，NoV易发生变异和重组，这些重组株的RdRp和VP1区基因分属于不同基因型。目前已发现的GI型NoV重组株包括GI.2/GI.6，GI.d/GI.3等[7-8]。因此全基因组序列的获得将有助于更全面准确的对病毒进行遗传进化分析。我们用自行设计的5对引物成功扩增了GI.8型NoV湖州株CHN/Huzhou/N10的全基因组序列， RdRp、VP1和VP2区的同源性分析和系统进化结果分析表明CHN/Huzhou/N10为GI.8型，未发生重组现象。

衣壳蛋白VP1作为NoV的主要结构蛋白可以折叠成2个区域，形成内壳的S区(Shell，S)和形成拱样凸起的P区(Protruding，P)。P区包括P1和P2两个亚区，分别构成拱样凸起的基底部和顶部，P2区位于衣壳的最外面，被认为是抗体识别和受体结合的关键部位，也是病毒序列最易变异的区域。目前GenBank上已有的GI.8型VP1全序列仅有5条，除了原型株Boxer/2001/US外，其余4条分别来自于2007-2008年中国、日本和美国检出的GI.8型NoV(Beijing/53671/2007/、JP/2007/Nagoya/KY531、2008890321/2008/US、CHN/Huzhou/N10)。此外，文献表明2008年杭州余杭地区的多起胃肠炎暴发中也曾检出GI.8型NoV[9]。以上有限的序列信息和文献报道提示GI.8型NoV在2008年前后在我国及其他国家有一定的流行。进一步VP1区氨基酸序列的分析表明，与原型株Boxer/2001/US相比，2007年以来检出的GI.8型NoV在P2区有11个共有的变异位点，其中aa347T→S，aa397T→E 这两个变异位点分别位于HBGA受体结合袋位点II和III内。这些位于P2区的氨基酸变异是否导致病毒抗原性和受体结合模式发生变化，从而影响了病毒的感染与流行，值得进一步研究。

NoV尚无法进行常规的细胞培养，基于分子生物学技术其进行遗传进化研究是目前认识病毒的重要方法。目前GenBank中唯一的1条GI.8基因组全序列(KJ196298)由日本上传，本文获得了我国GI.8型诺如病毒CHN/Huzhou/N10的全基因组序列，相关序列信息可用于病毒的遗传进化研究、快速诊断试剂的研发以及疫苗的设计。

[1] White PA. Evolution of norovirus[J]. Clin Microbiol Infect，2014，20(8): 741-745. DOI: 10.1111/1469-0691.12746[2] Ji L，Chen L，Wu X，et al. Rapid emergence of novel GII.4 sub-lineages noroviruses associated with outbreaks in Huzhou，China，2008-2012[J]. PLoS ONE，2013，8(12): e82627. DOI: 10.1371/journal.pone.0082627

[3] Qian MM，Xu HY，Zong Q，et al. Establishment of conventional RT-PCR and real-time RT-PCR to detect norovirus and its application[J].Chin J Zoonoses，2015，31(7): 602-606. DOI:10.3696/j.issn.1002-2694.2015.07.002 (in Chinese)

钱明明，许海燕，宗晴，等.常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、G型诺如病毒方法的建立及其应用[J]. 中国人兽共患病学报，2015，31(7): 602-606.

[4] Katayama K,Shirato-Horikoshi H,Kojima S,et al. Phylogenetic analysis of the complete genome of 18 norwalk-like viruses[J]. Virology,2002，299(2): 225-239.

[5] Tan M，Jiang X. Norovirus gastroenteritis，carbohydrate receptors，and animal models[J]. PLoS Pathog，2010，6(8): e1000983. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000983

[6] Kroneman A，Vega E，Vennema H，et al. Proposal for a unified norovirus nomenclature and genotyping[J]. Arch Virol，2013，158(10): 2059-2068. DOI: 10.1007/s00705-013-1708-5

[7] Bull RA，Tanaka MM，White PA. Norovirus recombination[J]. J Gen Virol，2007，88(12): 3347-3359.

[8] Bruggink LD，Oluwatoyin O，Sameer R,et al. Molecular and epidemiological features of gastroenteritis outbreaks involving genogroup I norovirus in Victoria，Australia，2002-2010[J]. J Med Virol，2012，84(9): 1437-1448. DOI: 10.1002/jmv.23342

[9] Gong LM，Ge Q，Chen Y，et al. Molecular characteristics of norovirus in 3 outbreak-episodes of gastroenteritis in Zhejiang from2008 to 2009[J]. Chin J Epidemiol,2011，2(5): 490-493. (in Chinese)

龚黎明，葛琼，陈寅，等. 浙江省2008-2009年三起诺如病毒胃肠炎暴发的病原分子特征分析[J]. 中华流行病学杂志， 2011，32(5):490-493.

Complete genome sequence of a genogroup I geno type 8 norovirus identified in Huzhou，China

JI Lei，WU Xiao-fang，CHEN Li-ping，HAN Jian-kang

(HuzhouCenterforDiseaseControlandPrevention，Huzhou313000，China)

We identified and characterized the full-length genome of a GI.8 norovirus strain CHN/Huzhou/N10 isolated in an outbreak in Huzhou，China. The full-length genome of CHN/Huzhou/N10 was amplified using five pairs of primers which were designed according to the full-length GI norovirus genome sequences published in GenBank database. Multiple alignments were performed using DNAStar，the phylogenetic relationship of CHN/Huzhou/N10 and the representative NoV (Norovirus) strains from each genogroup were assessed using the software MEGA version 6.0. The viral genome of CHN/Huzhou/N10 was 7 740 nucleotides in length，which was consist of three ORFs spanning 5-5 404 nt (ORF1)，5 388-7 019 nt(ORF2)，and 7 019-7 660 nt (ORF3)，respectively. Phylogenetic analysis based on polymerase and capsid sequences VP1 and VP2 region indicated that CHN/Huzhou/N10 belonged to GI.8 genotype. The amino acid sequence analysis of the VP1 region showed that CHN/Huzhou/N10 had 16 mutations compared with the representative strain Boxer/2001/US，12 of these variations were located in the P2 subregion. Moreover，a single amino acid change (T347S) occurred at histo-blood group antigen (HBGA) binding site II and another single amino acid change (T397E) occurred at HBGA binding site III. In this study，the first full genome of norovirus GI.8 isolated in Huzhou，China was extensively characterized. The data would be helpful not only for the epidemiology study，but also for the diagnostic tool development and effective vaccine design in the future.

norovirus; GI.8; complete genome

湖州疾病预防控制中心，湖州 313000 Email: jileichn@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.07.008

R373.2

A

1002-2694(2017)07-0613-04

2016-11-16 编辑：张智芳