兰翠娟

(河北省唐山市丰润区农业畜牧水产局，河北唐山064000)

双模板分子印迹聚合物-高效液相色谱法检测鸡肉中的喹诺酮类药物

兰翠娟

(河北省唐山市丰润区农业畜牧水产局，河北唐山064000)

喹诺酮类药物在动物体内的残留可能对消费者造成许多健康威胁。因此，中国农业部对喹诺酮类药物在多种动物源食品中的最高残留限量进行了规定，如鸡肉中沙拉沙星为10 ng/g。要对复杂样品中的目标物进行检测，第一步就是要对样品进行提取和净化。目前，兽药残留分析领域最常用的样品前处理方法是固相萃取法(SPE)[1-5]。SPE法使用的吸附剂容易受到样品杂质的干扰，可能会产生竞争性、非特异性吸附，且多为一次性使用的材料。近年来，分子印迹聚合物(MIP)作为一种新型材料受到了极大的关注。它可以耐受不同的极端pH值、高压和高温等条件，且可以重复使用上百次。目前，已有研究者利用不同喹诺酮类药物为分子模板制备了MIP，如诺氟沙星[6]、培氟沙星[7]、环丙沙星[8]、氧氟沙星[9]、恩诺沙星[10]和依诺沙星[11]。但由于喹诺酮类药物的分子结构不同，这些MIP的识别能力也不同，如基于诺氟沙星的MIP只能识别诺氟沙星，而基于氧氟沙星的MIP能识别6种药物。另外，这些MIP均是以单一分子为模板制备的。在本试验中，作者挑选了几种喹诺酮类药物组成了三组配对，以它们作为分子模板制备了3种双模板MIP，并评估其识别能力。然后制备一种MIP-SPE柱对鸡肉中的喹诺酮类药物进行提取和净化，用高效液相色谱法(HPLC)进行测定。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品 恩诺沙星、洛美沙星、环丙沙星、培氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星、氧氟沙星标准品，均购自美国Sigma公司；功能单体甲基丙烯酸和引发剂2,2-偶氮二乙腈，购自Kermer Chemical公司；交联剂2-甲基-2-丙烯酸-1,2-乙二醇酯，购自上海阿拉丁公司；液相色谱级乙腈，购自美国Dikma公司。喹诺酮类药物的标准储备液由甲醇配制(10.0 μg/mL)，系列浓度的工作液由纯水稀释而成(1-1 000 ng/mL)。

1.2 HPLC系统条件 HPLC系统由Waters 1525液相色谱、Waters 2998二极管阵列检测器(Waters，USA)和C18色谱柱(150×4.6 mm，5 μm)组成。流动相由(A)乙腈和(B)0.05%磷酸组成，双泵梯度洗脱，流速1.0 mL/min，进样量20 μL，检测波长278 nm和289 nm。梯度洗脱条件为：0～11 min，15%(A)，在4 min内线性升高至20%(A)，保持5 min，然后在2 min内降至15%(A)，保持3 min。

1.3 合成双模板MIP 基于三组混合模板分子(洛美沙星+恩诺沙星、沙拉沙星+氧氟沙星、环丙沙星+沙拉沙星)合成的MIP分别命名为MIP1、MIP2和MIP3。MIP合成过程如下：将2 mmol/L双模板分子，12 mmol/L功能性单体甲基丙烯酸和12 mL致孔剂氯仿加入到带盖的玻璃瓶中，振荡1 min，超声处理15 min，并在4 ℃保持过夜。然后，加入0.5 mmol/L交联剂和40 mg引发剂，氮吹10 min，密封，在60 ℃水浴中振荡24 h以完成聚合。将聚合物粉碎、研磨、过筛得到MIP颗粒。将MIP颗粒置入索式提取器中，用甲醇/乙酸(8/2，v/v)连续提取48 h，干燥备用。同时，按上述方法合成不含模板分子的对照聚合物(NIP)，用于和MIP比较。

1.4 建立MIP-SPE法 使用对喹诺酮类药物识别能力最佳的MIP制备MIP-SPE柱。称取50 mg MIP颗粒放入空的含玻璃筛板的PTFE柱中(90 mm×5.6 mm, i.d.)，依次用2 mL甲醇和2 mL纯水淋洗。将测试药物的溶液分别加到该SPE柱中，用3 mL水洗涤。然后，保留在柱上的药物用2 mL甲醇/乙酸(9∶1，v/v)洗脱，洗脱液在40℃水浴中蒸发至干。最后，用甲醇溶解并定容至0.5 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤后，HPLC检测。MIP-SPE柱用3 mL甲醇洗涤后可重复使用。在试验过程中，对洗脱条件、柱容量、回收率和再循环性能等参数进行了优化测试。

1.5 样品制备 称取2 g匀浆后的鸡肉样品置于20 mL的离心管中，加入10 mL乙腈，剧烈震荡5 min，然后，10 000 r/min离心5 min。将上清液转移到MIP-SPE柱上进行纯化，最后HPLC检测。在空白鸡肉中按10～300 ng/g的浓度分别添加不同喹诺酮类药物，按前述方法进行提取、检测，计算该方法的线性范围、检测限(信/噪比=3)、定量限(信/噪比=10)、回收率和变异系数。

2 结果与分析

2.1 不同MIP的吸附能力 在实验过程中，将7种喹诺酮类药物的标准工作液(1 000 ng/mL，1 mL)分别加到用3种双模板MIP制备的SPE柱上进行吸附，以甲醇洗脱，HPLC检测。结果如图1所示，3种MIP-SPE柱均可同时吸附这7种喹诺酮类药物，说明本研究中的双模板MIP能够识别分子结构差异较大的不同药物。但MIP2-SPE柱对7种药物的回收率整体高于其他两种SPE柱，说明沙拉沙星和氧氟沙星在聚合物表面形成的混合印迹对喹诺酮类药物的识别能力更强。因此，选择MIP2-SPE柱用于后续试验。

图1 3种MIP-SPE柱对喹诺酮类药物的回收率

2.2 洗脱液的优化 在实验过程中，将7种喹诺酮类药物的混和标准液(500 ng/mL，1mL)分别加到多个MIP2-SPE上，用不同的洗脱液进行洗脱后，HPLC 检测。结果显示，含乙酸或氨水的甲醇和乙腈对7种药物的回收率(80%～100%)整体高于纯甲醇和纯乙腈的回收率(70%～92%)，这是因为加入乙酸或氨水后的洗脱液极性更高，有利于破坏聚合物和药物之间形成的亲和力，从而获得更高的回收率。在几组洗脱液中，用甲醇/乙酸(9∶1，v/v)为洗脱液时的回收率最高(94%～100%)，因此，选择该溶液用于后续试验。

2.3 MIP2-SPE柱的性能 在最佳条件下，该萃取柱对7种药物的柱容量范围为4 900～5 040 ng，对7种药物回收率均≥93%(表1)，表明该萃取柱可以在很大浓度范围内对这7种药物的残留进行提取。另外，为了测试其重复使用情况，以沙拉沙星和氧氟沙星为代表药物，按上述方法对6根MIP2-SPE柱进行了试验。结果表明，在连续使用50次后，两种药物的平均回收率只下降了9%，说明该MIP2-SPE柱非常耐用。为验证该MIP2-SPE柱对这7种喹诺酮类药物的吸附是由于特异性识别，在试验过程中，将MIP2-SPE柱和NIP-SPE柱进行了比较。将7种喹诺酮类药物和3种其他种类的药物(四环素、阿莫西林、苏丹红1号)分别加到MIP2-SPE柱和NIP-SPE柱上进行吸附、洗脱。结果如图2所示，MIP2-SPE柱对喹诺酮类药物的回收率远高于对其他3种药物的回收率(低于30%)，而NIP-SPE对这10种测试药物的回收率相当(约30%)，说明MIP2-SPE发挥的是特异性识别作用。

图2 MIP2-SPE柱和NIP-SPE柱吸附性能的比较

表1 MIP2-SPE柱性能及MIP-SPE-HPLC检测参数(n=5)

2.4 添加回收试验 在试验过程中，用空白鸡肉的提取液分别配制7种喹诺酮类药物的溶液，经HPLC检测，以确定该方法的检测参数，结果如表1所示。另外，从图3看出，在空白鸡肉的色谱图中7种药物的色谱峰周围没有其他杂质峰，说明该MIP2-SPE的净化效果令人满意。为验证该MIP-SPE-HPLC方法的准确度和精密度，在空白鸡肉中按10～300 ng/g的浓度分别添加7种药物，按前述方法进行提取、检测。结果表明，该方法对7种药物的日间回收率为76.5%～91.8%，日内回收率为78.0%～93.1%，变异系数低于11.2%(表2)。以上结果表明，该MIP-SPE-HPLC可以作为一种简便、耐用、准确的方法用于喹诺酮类药物的残留检测。

表2 MIP-SPE-HPLC法的准确度及精密度 (n=6)

2.5 与其他SPE柱的比较 本试验是首次报道以双模板MIP制备SPE柱用于喹诺酮类药物的残留检测。为比较与普通SPE柱的差异，本试验中空白添加样品的提取液分别用两种含有不同吸附剂的商品化SPE柱(HLB和C18)进行纯化，然后HPLC检测，重复3次。结果表明，商品化HLB柱的回收率(74%～83%)和C18柱的回收率(22%～31%)都比MIP-SPE柱的低。并且这两种商品化SPE柱的净化效果也比MIP2-SPE柱差。如图3所示，使用商品化SPE柱时，在药物的色谱峰周围存在不同的干扰峰，说明它们会对样品中的杂质产生非特异性吸附，从而会干扰对目标物的检测。

3 结论

作为一种新型吸附剂，MIP已被用于多种物质残留的提取净化。本文中制备的双模板MIP可以用于提取净化鸡肉中的7种喹诺酮类药物，在识别药物数量方面优于已有的相关报道，但其对其他未测试的本类药物的识别性能有待进一步研究。如果能够找到更合适的模板分子，制备能识别所有此类药物的MIP，则可以实现此类药物更大范围的残留监控，这也仍有待研究。

图3 喹诺酮类药物不同情况下的色谱图

a：标准品； b：空白鸡肉，空白样品添加药物后经； c：MIP柱； d：HLB柱； e：C18柱净化(1：氧氟沙星, 2：环丙沙星, 3：培氟沙星, 4：洛美沙星, 5：恩诺沙星, 6：沙拉沙星, 7：二氟沙星)

[1] Zeng Z, Dong A, Yang G,etal. Simultaneous determination of nine fluoroquinolones in egg white and egg yolk by liquid chromatography with fluorescence detection [J]. J Chromatogr B， 2005，821：202-209．

[2] Marazuela M D, Moreno-Bondi M C. Multiresidue determination of fluoroquinolones in milk by column liquid chromatography with fluorescence and ultraviolet absorbance detection [J]. J Chromatogr A，2004，1034：25-32．

[3] Li Y L, Hao X L, Ji B Q,etal. Rapid determination of 19 quinolone residues in spiked fish and pig muscle by high-performance liquid chromatography (HPLC) tandem mass spectrometry [J]. Food Addit Contam，2009，26：306-313．

[4] Lara F F. Multiresidue method for the determination of quinolone antibiotics in bovine raw milk by capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry [J]. Anal Chem，2006，78： 7665-7673．

[5] Tang Q F, Yang T T, Tan X M,etal. Simultaneous determination of fluoroquinolone antibiotic residues in milk sample by solid-phase extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. J Agric Food Chem，2009，57：4535-4539．

[6] Xu Z, Kuang D, Liu L,etal. Selective adsorption of norfloxacin in aqueous media by an imprinted polymer based on hydrophobic and electrostatic interactions[J]. J Pharmaceu Biomed Anal，2007，45(1) ：54-61．

[7] Zheng M M, Gong R, Zhao X,etal. Selective sample pretreatment by molecularly imprinted polymer monolith for the analysis of fluoroquinolones from milk samples [J]. J Chromatogr A，2010，1217：2075-2081．

[8] Feng M X, Wang G N, Yang K,etal. Molecularly imprinted polymer-high performance liquid chromatography for the determination of tetracycline drugs in animal derived foods [J]. Food Control，2016，69：171-176．

[9] Tan F, Sun D, Gao J,etal. Preparation of molecularly imprinted polymer nanoparticles for selective removal of fluoroquinolone antibiotics in aqueous solution [J]. J Hazard Mater，2013，244/245：750-757．

[10] Luaces M D, Urraca J L, Pérez-Conde M C,etal. Chemiluminescence analysis of enrofloxacin in surface water using the tris(1,10-phenantroline) -ruthenium(II)/ peroxydisulphate system and extraction with molecularly imprinted polymers [J]. Microchem J，2013，110：458-464．

[11] Urraca J L, Castellari M, Barrios C A,etal. Multiresidue analysis of fluoroquinolone antimicrobials in chicken meat by molecularly imprinted solid-phase extraction and high performance liquid chromatography [J]. J Chromatogr A，2014，1343：1-9．

2016-11-17

兰翠娟(1977-)，女，高级兽医师，本科，从事动物检疫工作，E-mail: weiyinga@126.com

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0529-6005(2017)04-0099-04