向卫军，杨涛涛，刘 浩，罗季伟，余兴龙

(1.湖南农业大学动物医学院， 湖南长沙410128； 2.长沙市动物卫生监督所， 湖南长沙410013)

生猪乙型脑炎抗体消长规律及蚊子携带乙脑病毒调查

向卫军1，杨涛涛1，刘 浩2，罗季伟1，余兴龙1

(1.湖南农业大学动物医学院， 湖南长沙410128； 2.长沙市动物卫生监督所， 湖南长沙410013)

为探寻猪场仔猪乙型脑炎抗体消长与蚊子携带乙型脑炎病毒的之间的关系， 4月份选取一批约15日龄仔猪共24头， 每隔20 d采血1次， 至7月共采血6次， 用间接ELISA 方法检测血清乙型脑炎抗体， 且不同时间在跟踪猪舍共捕获约3720只蚊子， 用RT-PCR 方法鉴定乙型脑炎病毒核酸； 结果表明， 该批猪乙型脑炎抗体阳性率总体呈现先下降后升高规律， 阳性率先后为83.3%、 66.7%、 41.6%、 25%、 50%、 91.6%， 生猪体内母源抗体水平在75日龄(6月20日)达到最低， 阳性率降至25%， 然后呈现明显的上升趋势， 115日龄(7月30日)检测阳性率高达91.6%； 37份蚊子样品， JEV核酸阳性样品16份， 阳性率高达43.2%， 其中7月份所采集14份蚊子样品检出7份，乙型脑类病毒(JEV)阳性检出率最高达50%， 表明在乙型脑炎流行季节， 受蚊子携带病毒及其叮咬影响， 当仔猪JEV抗体下降最低时JEV易感， 后期感染抗体升高。

乙型脑炎病毒 ； 仔猪 ； 抗体 ； 蚊子

流行性乙型脑炎是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒引起的一种重要的蚊媒性人兽共患传染病，多种动物易感。对于易感动物来说，乙型脑炎是一种潜在的致死性病毒性感染疾病，也是严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统的急性传染病，同时也是亚洲病毒性脑炎的主要原因。乙型脑炎以三带喙库蚊为主要传播媒介，属于自然疫源性疾病，猪是乙型脑炎病毒的重要贮存宿主与增殖宿主，是乙型脑炎的主要传染源，也是对人类威胁最大的扩散宿主，主要流行模式是JEV在“蚊-猪-蚊”中循环繁殖。JEV可引起妊娠母猪发生流产和死胎、公猪发生睾丸炎，新生仔猪发生脑炎、育肥猪持续高热，对养猪业造成巨大的经济损失。在JE流行季节，猪在自然感染后形成病毒血症，JE病毒血症会持续2～4 d并且能感染蚊子。Burke等[1]通过血清学调查，猪始终比其他家畜或野生动物有更高的病毒滴度，猪群对吸血蚊子更具有吸引力，所以猪群在JEV流行区提供该病毒传播的敏感指示器。Gajanana等[2-3、7-8]研究发现，人类感染JEV通常是因为被感染的蚊子叮咬，同时对JEV生态学发现，病毒的传播与蚊虫的滋生环境有很大关系，其病毒媒介(蚊子)以及人类居住区附近的生猪养殖场等之间相互影响。在JEV流行区域，特别是生猪养殖的地区，猪作为JEV传播的敏感指示器，对其进行血清学调查、猪群养殖环境中蚊虫检测具有重要意义。笔者于2015年4月～7月，即湖南地区蚊虫开始出没至蚊虫繁殖高峰期这一时间段，在湖南某种猪场通过对一批猪从15日龄～115日龄进行纵向跟踪采血并检测JEV抗体，同时定期采集实验猪栏舍环境中蚊子进行JEV核酸检测，探寻两者之间关系，提出免疫时间等，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 猪血清样品 2015年4月，在湖南省岳阳汨罗某种猪场选取未经JEV流行季节的仔猪，选取同批次约14日龄仔猪共12窝，每窝随机选取2头，共24头，第一次采血做好耳标标识，每隔20天左右采血1次，共采血6次。

1.2 蚊子采集

1.2.1 采集点 在采血跟踪猪栏舍放置捕蚊灯，栏舍前中后各放置一套，每隔2周采集1次。

1.2.2 捕蚊方法和鉴定 于2015年4月16日至7月30日期间，晚20:00至22:00，用日光灯诱蚊捕获蚊子，栏舍内挂3个诱蚊灯，捕获蚊虫经-20 ℃冻死，进行计数、分装入塑料管，标号登记，用于乙脑病毒的鉴定。

1.3 试剂

1.3.1 猪乙型脑炎病毒抗体检测试剂盒 猪乙型脑炎ELISA 抗体试剂盒为武汉科前生物股份有限责任公司产品，用于猪乙型脑炎病毒抗体检测(试剂盒批号：20141108)。

1.3.2 RNA提取、CDNA合成 柱式病毒RNAout试剂盒、即用型PCR试剂盒均为北京天恩泽基因科技有限公司产品；DM-2 000 plus marker为康为世纪公司产品。

1.4 样品处理与检测

1.4.1 样品预处理 将不同时间段、不同采集点所采集的蚊子样品分别分装到2 mL离心管中，每管100只，然后加入无RNA水于匀浆机研磨2min，4 ℃条件下12 000r/min离心5min后取200 μL上清用于提取RNA。

1.4.2 蚊虫RNA提取、cDNA合成 参照天恩泽基因柱式病毒RNAout试剂盒说明书提取蚊子样品滤液的RNA，并按Thermo逆转录试剂盒说明书合成cDNA，PCR反应程序为25 ℃/20 min；42 ℃/45 min；72 ℃/5 min；10 ℃保存，反转录完毕后将cDNA放入-20 ℃保存。

1.4.3 PCR鉴定 采用天恩泽基因即用型PCR试剂盒配制体系并扩增。根据JEV NS5设计引物，上游引物：5′-AAGCCCTCAG AACCGTCTCG-3′；下游引物：5′-CTCCTCTAACCTCTAGTCCTTC-3′PCR反应程序：94 ℃ 预变性5 min，开始PCR循环，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，扩增35个循环，最后72 ℃延伸7 min。取5 μL PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

2结果

2.1 24头仔猪15日龄至115日龄6次跟踪血清乙型脑炎抗体结果 见表1。根据试剂盒说明书，若样品S/P值≥0.21，判为猪乙型脑炎病毒抗体阳性；样品S/P值<0.21，判为猪乙型脑炎病毒抗体阴性。结果显示，抗体阳性率与平均S/P值总体呈现先下降后升高规律，而且两者在时间上一致，JEV抗体平均S/P先后为，0.335、0.221、0.211、0.210、0.232、0.311，从表1可看出下降最低点为75日龄，从15日龄0.335下降至75日龄0.210，上升最高点为115日龄，从75日龄0.210至115日龄0.311；JEV抗体阳性率先后为83.3%、66.7%、41.6%、25%、50%、91.6%，从图2可看出，75日龄(6月20日)为25%，为阳性率最低时开始呈现明显的上升趋势，至115日龄(7月30日)阳性率高达91.6%。

表1 不同日龄阶段猪JEV抗体平均S/P值

图1 各日龄阶段猪JEV抗体平均阳性率

图2 RT-PCR鉴定蚊子样品JEV阳性样品

1：阴性对照， 2：阳性对照， 3：阴性样品， 阴性， 4：弱阳性样品，5：阳性样品

2.2 蚊子样品中JEV阳性样品PCR鉴定 PCR扩增乙型脑炎NS5基因片段，符合目的条带大小(约270 bp)定为阳性样品，PCR扩增产物经电泳后结果(见图3)。共对37份蚊子样品进行了JEV鉴定，JEV阳性样品共16份，阳性率为43.24%。从4月20日至7月30日，六次采集蚊子样品总份数、JEV核酸检测率(见表2 )，同时统计2015年4月至7月每半个月中，每日最高与最低平均气温与核酸检测率的关系(见图3)，可得出JEV核酸检出率随气温升高有逐渐增加的趋势。

图3 JEV核酸检出率与平均气温

表2 蚊子样品采集及其JEV核酸检测

注：1份蚊子样品大约100只

3 结论与讨论

经过本调查研究，在乙型脑炎流行、蚊虫活跃季节、适合蚊虫滋生的猪场， 未免疫仔猪JEV抗体的先下降后升高的过程，这与猪场环境中蚊子密度、携带JEV病毒量以及气温有关，气温越高蚊子活动越频繁，单位时间蚊子叮咬次数增加，JEV通过蚊子传播机率越大。

经调查国内大部分猪场只有种猪注射JEV疫苗[4-6]，根据这次跟踪猪场免疫程序，每年3、9月份种猪普免、后备猪留种前进行2次乙型脑炎疫苗免疫，但是仔猪不免疫JEV疫苗，在流行季节猪只有感染JEV后导致抗体升高的可能。由于母源抗体的存在，15日龄仔猪阳性率与S/P值较高，随之慢慢下降，抗体拐点在75日龄(7月30日)，检测的S/P值与阳性率分别为0.210%、 25%，从此日龄阶段抗体开始呈现明显的上升趋势，至115日龄(7月30日)检测S/P值为0.311%，阳性率高达91.6%，说明在母源抗体较低的猪只被携带病毒的蚊子叮咬后，仔猪感染JEV后使抗体值得以升高。同时统计2015年4月至7月份每半个月中，每日最高与最低平均气温与JEV核酸检测率的关系中可得出JEV核酸检出率随气温升高有逐渐增加的趋势，这样随着气温的升高，蚊子密度的增大、感染猪只增多，JEV量通过“蚊-猪-蚊”循环得以增加，将所采集的蚊子检测做JEV核酸检测，结果发现蚊虫JEV感染率高达43.2%，魏燕鸣[7]2009年6月至8月在湖北、安徽两省部分猪场采集蚊子样品检测JEV，53 份样品中阳性样品有44 份，阳性率达83%，表明在JEV流行季节，猪场蚊子带JEV阳性率较高，在蚊子活跃、乙型脑炎流行的高温季节，受蚊子携带病毒及其叮咬影响，当仔猪JEV母源抗体下降最低时JEV易感，后期感染抗体升高。

在当前大部分猪场免疫方式下，即只免疫种猪不免疫仔猪，在蚊虫活跃季节，未免疫猪存在乙型脑炎感染的高风险，根据该场仔猪JEV抗体消长规律，建议在仔猪50至55日龄猪免疫一次乙型脑炎疫苗，可以有效防止JEV对育肥猪感染后引起发热、后备种猪繁殖障碍等情况，更重要的是在“蚊-猪-蚊-人”这一循环中，有效减少乙型脑炎病毒放大宿主猪的载毒量，从而减少蚊子携带病毒的含量，乙型脑炎是季节性流行病，各猪场应根据不同季节、本场仔猪乙型脑炎母源抗体消长情况、感染情况等科学制定乙型脑炎免疫程序，这对乙型脑炎病毒疾病控制以及人类公共卫生方面有着重要意义。

[1] Burke D S,Tingpalapong M,Ward G S,etal.Intense transmission of Japanese encephalitis Virus to pigs in a region free of epidemic encephalitis [J].Southeast Asian J Trop Med Public Health，1985,16:199-206.

[2] Gajanana A，Rajendran R，Sanmuel P P,etal. Japanese encephalitis in south Arcot district,Tami Nadu,India:a three-year longitudinal study of vector abundance and infection frequency[J].Med Entomol ，1997.34:615-659.

[3] Kanojia P C,Shtty P S,Geevarghese G.A long-term Study on vector abundance & seasonal prevalence in relation to the occurrence of Japanese ence phalitis in Gorakhpur district,vttar Pradesh[J].Indian J Med Res ，2003.117:104-110.

[4] 杨培昌，曹兴萍，高自寿，等.云南省楚雄州猪乙型脑炎流行情况血清学调查[J].动物医学进展，2008，29(5) :109-112.

[5] 陈孝明，亓文宝，张桂红，等.广东省部分规模化猪场乙脑抗体的监测与分析[J].广东农业科学，2010 (9) :154-155.

[6] 靳兴军，韩磊，纪蔚红，等.北京市猪乙型脑炎血清流行病学调查[J].中国兽医杂志，2008，44(8) :51-52.

[7] 魏燕鸣. 猪场蚊子中乙型脑炎病毒的RT-PCR检测[J]. 湖北农业科学，2012, 51(14):3104-3106.

Study on the growth and decline of maternal antibody of Japanese encephalitis B virus and investigation of mosquito carrying virus

XIANG Wei-jun1, YANG Tao-tao1, LIU Hao2, LUO Ji-wei1, YU Xing-long1

(1.College of Veterinary Medicine , Hunan Agriculture University , Changsha 410128 , China ; 2.Changsha Animal Health Supervision Institute , Changsha 410013 , China)

To investigate the link between the dynamical changes of JEV in piglets and JEV in mosquitos. Twenty-four 15-day old piglets were selected and blood samples were collected 6 times every 20 days. Then, we used indirect ELISA method to detect serum antibody against JEV. At the same time, a total of 3720 mosquitos were trapped, and Japanese encephalitis virus nucleic acid was detected by RT-PCR. Results showed that the positive rate of antibody against Japanese encephalitis Bwas declined at the beginning and then increased. The positive rate for 83.6%, 83.3%, 66.7%, 41.6%, 25%, 50%, and 91.6%. The positive lowest rate was 25% in Aprilm and the highest positive rate was 91.6% in July. Of the 37 samples of mosquitos, 16 was JEV nucleic acid positive, and positive rate is as high as 43.2%. Of the 14 samples in July, 7 samples were positive, and the positive rate of JEV was 50%. These findings indicate that when mosquitoes are active in Japanese encephalitis epidemic season, the piglets haves, higher JEV antibody positive rate, suggesting a higher JEV infection rate.

Japanese encephalitis virus; Piglets; Antibody; mosquitoes

YU Xing-long

2016-08-21

国家自然科学基金(30972191)；吉林省留学人员创新创业项目(201523)；长春市农业先进实用技术的示范推广项目(20130215)；农业部948项目(2014Z34)

向卫军(1983-)，男，博士生，主要从事动物疾病发病机理及防控研究，E-mail:124068146@qq.com

通迅作者: 余兴龙，E-mail:xlyu999@126.com

S852065+1

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0529-6005(2017)04-0027-03