邢 奕,王志强,李益飞,洪 晨,3*,沈 茜,杨 强



不同粒度CuO及与乙基黄原酸钾复合污染对土壤脲酶和微生物多样性的影响

邢 奕1,2,王志强1,李益飞1,洪 晨1,3*,沈 茜1,杨 强1

(1.北京科技大学能源与环境工程学院,北京 100083；2.北京科技大学工业典型污染物资源化处理北京市重点实验室,北京 100083；3.中国科学院生态环境研究中心,北京 100085)

纳米氧化铜不同于常规的氧化铜,纳米氧化铜的尺寸小,比表面积大,对生态环境存在潜在危害.本次通过向土壤中加入不同比例的纳米氧化铜(N CuO)和微米氧化铜(M CuO)(0,50,200,800,1600mg/kg干土)观察它们对土壤脲酶活性和细菌群落的影响.同时,进一步研究了N CuO和M CuO分别与乙基黄原酸钾(PEX)复合污染对土壤微生物的影响.N CuO较M CuO对脲酶活性有更强的抑制作用,只有M CuO浓度为1600mg/kg对脲酶的影响较明显.N CuO对脲酶活性的抑制可能与破坏细菌的细胞膜或刺激细菌产生活性氧,造成细菌细胞的衰退有关,N CuO对细菌群落结构的影响也较大.N CuO与PEX复合污染加剧了N CuO对土壤微生物的毒性,使脲酶的活性大幅度降低,细菌的群落结构也发生了较大的变化.N CuO及其复合污染对土壤微生物的作用机制需进一步研究.通过比较研究N CuO和M CuO的生态毒性,纳米颗粒的生态毒性更需要引起足够的重视.

纳米氧化铜颗粒；微米氧化铜颗粒；乙基黄原酸钾；脲酶活性；微生物多样性

土壤中的纳米颗粒比空气和水中的要多,具有潜在的环境生态风险[1-4].目前,有关纳米颗粒的研究多集中在单一或多种工程纳米颗粒对土壤微生物量、酶活性、微生物多样性及群落结构的影响[5-7].而纳米颗粒作为矿山开采活动中的一种特殊排放[8],会与矿山药剂对矿区土壤造成复合污染,目前这方面的研究较少.矿区土壤的复合污染研究多集中在多种金属离子和金属离子与选矿药剂的复合污染[9-12].

土壤酶直接参与土壤的物质循环和能量代谢过程,能反映土壤微生物总体活性,研究表明,脲酶活性与微生物的数量呈正相关,在土壤氮元素的循环与转化过程中扮演重要角色[13].土壤微生物是气候和土壤环境条件变化的敏感指标,微生物群落的改变是影响土壤功能的简单又灵敏的指示[14-15].高通量测序技术具有成本低、通量高和信息丰富等特点[16],实现了大尺度空间上土壤微生物物种和结构多样性的研究[17-19].与微米颗粒相比,纳米颗粒有更大的比表面积、更强的反应能力和更大的溶解性,决定了纳米颗粒可能对环境中的微生物有更强的毒性.本次研究了不同尺寸的CuO及与选矿药剂乙基黄原酸钾复合污染对土壤脲酶和微生物多样性的影响.为金属纳米材料及与其他物质复合污染对土壤生态系统的影响提供一定的基础信息和理论依据.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

纳米氧化铜(<100nm)、微米氧化铜(500nm~10mm)和乙基黄原酸钾购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,纳米氧化铜(N CuO)为近圆球形粒子,微米氧化铜(M CuO)为不规则颗粒状,样品纯度>99.8%.

供试土壤:采样地区是位于中国东北部内蒙古自治区的满洲里市西南方约22km处乌奴格吐山的铜钼矿周边的天然牧场.采集五个不同位置的表层土壤(£20cm),密封于塑料封口袋内进行储存和运输,运输过程中将土壤放入加满冰块的保温箱中.带回实验室后,将5个土样混合均匀,一部分在室温(20°C~25°C)下风干,研磨,经过2mm的尼龙筛用作土壤理化性质的分析,另一部分混合后的土壤稍加研磨过2mm尼龙筛后装入塑料袋中置于4℃的冰箱内保存,用作酶活性及微生物多样性的分析.

1.2 土壤理化性质的测定

土壤的理化性质采用常规的测试方法[20],测定方法和结果如表1.

表1 土壤基本的理化性质

1.3 实验设计

取出冷藏于冰箱中的土样,使其含水率保持在45%,在25℃的培养箱中预培养7d,以恢复土壤中微生物的活性.7d之后将土样继续放在25℃的培养箱中,至土样可以成为粉末状.将N CuO和M CuO分别以0,50,200,800,1600mg/kg干土的比例加入到土壤中混匀.乙基黄原酸钾(PEX)配成各种低浓度的母液后,分别以0,10,50,100, 300mg/kg干土的比例加入到土壤样品中,以不加任何污染物质的土壤作为空白对照土壤.加入的方式分为两种,一种为N CuO、M CuO和PEX单独加入到土壤中,另一种是加入N CuO和M CuO后再加入PEX进行复合污染.不同处理后的土壤样品加入去离子水,使含水率保持在45%,放在温度为25℃的培养箱中进行黑暗培养.在第1,7,14, 21,28d时测定每个土壤样品的脲酶活性,每个处理设置三次重复.由于土壤中细菌的种类较多,为了更明显的观察不同污染物对土样群落结构造成的影响,选择加入较高浓度污染物的土样在较长的培养时间后,测定细菌组成的变化.因此,在培养60d后,测定空白对照土样Blank和单一污染N CuO(1600mg/kg)、M CuO(1600mg/kg)和PEX(300mg/kg)以及复合污染的N CuO+PEX (1600+300mg/kg)和M CuO+ PEX(1600+300mg/ kg)这6种加入不同污染物的样品的细菌群落结构的差异,每个样本3次重复,测定结果取平均值.其中,原始土壤的脲酶活性为0.474mg NH3-N/ (g·h),原始土壤门水平及属水平的细菌群落组成情况如图1.

1.4 土壤酶活性及微生物多样性的测定方法

本次研究中,脲酶的测定使用靛酚蓝比色法[21].微生物群落多样性采用高通量测序技术.土壤DNA的提取及PCR扩增如下:土壤DNA使用试剂盒提取.PCR扩增区域为16S V3-V4,扩增引物为338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT).PCR反应体系包括:30ngDNA模板、dNTPs(2.5mM) 4μL、10 ×Pyrobest Buffer 5μL、Pyrobest DNA聚合酶0.3μL、正反向引物(10uM) 各2μL和蒸馏水共50μL.PCR扩增程序为:95℃预变性5min; 95℃变性30s,56℃退火30s和72℃延伸40s共25个循环,72℃最终延伸10min,4℃保温.配制2%的琼脂糖凝胶电泳检测实验结果并纯化PCR扩增产物.建立MiSeq文库并通过Illumina平台(MiSeq)进行Paired-end 测序.

1.5 数据处理与分析

1.5.1 土壤酶活性的数据处理 数据处理使用Microsoft excel 2010和SPSS 21,作图使用Origin 8.0.酶活性抑制率的计算公式:

酶活性抑制率(%)=100%´(对照-处理)/对照

式中:对照为空白对照组中脲酶的活性,处理为加入不同的污染物后的脲酶活性.

为了进一步了解N CuO、M CuO与PEX是否存在交互作用,计算酶活性的净变化量△U;

△=(CuO+PEX-blank)-(CuO-blank)-

(PEX-blank)

其中:CuO+PEX表示N CuO或M CuO与PEX复合污染后测得的土壤脲酶活性;CuO为N CuO和M CuO单独污染时的土壤脲酶活性;blank表示空白对照土壤的脲酶活性.△=0,表示PEX与N CuO或M CuO之间无交互作用;△>0,二者存在拮抗作用;△<0,二者表现为协同作用.

1.5.2 细菌多样性 通过Illumina平台(MiSeq)进行Paired-end 测序,下机数据经过预处理去除低质量的reads,然后根据PE数据之间的overlap关系将成对的reads拼接成一条序列.为了得到高质量的序列,去除tags两端的barcode序列及引物序列,引物错配数最高为2,利用Mothur软件去除长度小于200bp的序列及其maxhomop大于10的序列,用Usearch(vertion8.0)软件去除嵌合体最终得到clean_tags.拼接过滤后的clean_tags,在0.97相似度下利用QIIME (v1.8.0)软件将16s序列聚类为用于物种分类的OTU,并构建稀释曲线.利用Mothur计算不同随机样本的shannon值,各个样品的物种组成使用QIIME软件得到,使用R(v3.1.1)软件绘制稀释曲线、Shannon-Wiener曲线、韦恩图和物种组成柱形图.

2 结果与讨论

2.1 单一污染对土壤脲酶活性的影响

不同浓度的N CuO、M CuO和PEX单独加入到土壤后,土壤脲酶的变化见图2.由图2a可知,加入不同浓度的N CuO,培养1d后,土壤脲酶活性有所增加,可能是加入N CuO后,杀死部分土壤微生物,从而释放出一些胞内酶,导致脲酶活性暂时升高[13].培养时间越长、浓度越高,N CuO对脲酶的抑制作用越明显,在培养的第28d时,与空白对照土壤相比,脲酶的活性均显著降低(£0.05),抑制率分别为6.18%、8.31%、14.01%和16.32%,可能是由于N CuO的抑菌作用,导致产生脲酶的微生物的活性降低、数量减少.有研究发现N CuO对多种细菌的生长都有抑制作用[22-24],这种抑制作用与N CuO引起细胞膜损伤有关[25].同时,纳米颗粒会导致活性氧的产生,微生物细胞产生氧化应激反应,导致细胞衰退,最终导致土壤酶的产生和分泌减少[26-27].与N CuO相比,M CuO对土壤脲酶活性的影响较小,如图2b.M CuO浓度为1600mg/kg时,在整个培养期间对土壤脲酶一直表现为抑制作用.在培养28d时,浓度为50和200mg/kg的M CuO对土壤的抑制减弱抑制率分别为2.11%和3.61%,而浓度为800和1600mg/kg的M CuO对土壤的抑制率分别是10.19%和8.40%.高浓度的M CuO释放的Cu2+较多,有研究表明M CuO对土壤脲酶活性的影响是通过释放Cu2+实现的,M CuO本身的毒性很小[28];图2c为加入不同浓度的PEX对土壤脲酶活性的影响.第7d时,不同处理土壤样品的脲酶活性达到最高,可能是由于PEX的加入,改变了酶促反应的平衡,导致微生物分泌的脲酶增加[28],从培养的第14d起,加入PEX的土壤脲酶活性与空白土样相比显著降低(£0.05),可能是由于高浓度PEX的毒性作用,杀死了部分土壤微生物,导致土壤中的微生物数量减少.

2.2 复合污染对土壤脲酶活性的影响

图3为N CuO和M CuO分别与PEX复合胁迫对土壤脲酶的影响.由图3a和3b可知,N CuO与M CuO分别与PEX复合胁迫下,在加入污染物1d后,土壤脲酶的活性均有所降低.在培养时间为7d时,土壤脲酶活性最高.与M CuO和PEX复合污染相比,N CuO与PEX复合污染对土壤脲酶的抑制作用更明显.

复合污染的作用机制与污染物的种类及浓度组合、污染物的结构与性质、污染时间以及生物种类等多种因素相关[30].表2为复合污染后的净变化量,低浓度N CuO (50mg/kg)与PEX (10mg/kg)复合胁迫对土壤脲酶活性主要表现为拮抗作用,可能是由于加入的N CuO含量较少,部分N CuO与土壤有机质和黏土矿物结合[30],N CuO溶出的部分Cu2+与PEX反应.

高浓度的N CuO与PEX复合污染对土壤脲酶表现为协同作用,可能是由于N CuO造成了细胞膜损伤,使PEX进入细菌细胞内部,使胞内代谢系统发生紊乱、生物化学成分发生改变,同时菌膜的损坏也会导致菌体内的物质发生泄漏,使菌死亡[32-33].有研究表明,纳米ZnO附着在菌膜上,对菌的形态产生一定的影响,如使菌膜某些部位变形或凹陷,改变菌膜的渗透性[34].与N CuO和PEX复合污染不同,M CuO和PEX复合污染对土壤脲酶活性主要表现为拮抗作用.可能是由于M CuO对脲酶活性的影响主要是由于释放的Cu2+造成的,而释放的Cu2+与PEX发生化学反应生成黄原酸铜,黄原酸铜的溶解性很低,可能是造成两者复合胁迫对脲酶产生拮抗作用的原因.有机酸可与金属离子形成生物体几乎不能吸收、蓄积的物质形态,这是减毒的重要机制[35].

表2 复合污染条件下脲酶活性的变化量

2.3 加入不同污染物后土壤细菌群落结构的变化

2.3.1 土壤样品测序结果及取样深度验证 样品测序数据统计见表3.采用随机取样的方法抽取数据,以抽到的序列数和它们所能代表OTU的数目构建稀释曲线(图4a),稀释曲线可以反映取样的深度,用来评价测序量是否覆盖所有的类群.6个样品的稀释曲线均趋于平缓,但未达到饱和,说明取样基本合理,能够较真实的反应土壤样本的细菌群落.各样本的覆盖率指数显示在相似度为0.97的条件下, OTUs涵盖了土壤中85.97%~90.21%的细菌.Shannon-Wiener曲线(图4b)是反映样本微生物多样性的指数,指数越大表明群落的复杂程度越高[36].由图4b看出,污染物N CuO和M CuO对土壤细菌群落多样性的影响不大, N CuO与PEX的复合污染造成了细菌群落多样性的减少,可能是受到N CuO和PEX双重筛选的结果.图4c为在0.97的相似度下,绘出的韦恩图,直观展示样品间OTU的重叠情况.其中5个土壤样品有1672OTUs是相同的,由图5a可知,相同的OTUs主要来源于Proteobacteria(变形菌门)和Actinobacteria(放线菌门),细菌类群具有良好的同源性,是由于供试的土壤是相同的[37].但是,每个样品与对照样品相比均有不同的OTU出现,表明细菌多样性受到了加入污染物不同程度的影响.

表3 样品测序数据统计

注 :PN CuO表示PEX+ N CuO(300+1600mg/kg),PM CuO表示PEX +M CuO(300+1600mg/kg).

2.3.2 土壤细菌组成 图5a为在门水平上群落结构和分类结果.加入不同的污染物后,土壤微生物的群落结构发生了不同的变化.6个土壤样品中,优势种群均为Proteobacteria和Actinobacteria.Proteobacteria和Actinobacteria在空白对照土壤中所占比例分别为30.28%和34.92%,在加入M CuO、N CuO、PEX、PEX +M CuO 和PEX+ N CuO后,Proteobacteria在土壤样品中所占比例分别为27.98%、29.22%、34.02、37.89%和43.27%, Actinobacteria所占比例分别为34.92%、30.3%、18.96%、24.4%、22.96%和15.05%.在属水平上,文章对细菌群落的变化又作出了更进一步的分析,如图5b.可以看出,几个样品的优势属没有发生改变, DA101在空白样中所占比例为2.27%,而加入M CuO、N CuO、PEX、PEX +M CuO 和PEX+ N CuO后,所占比例分别达到了2.67%、7.38%、5.32%、6.9%和4.34%,说明DA101对加入的污染物有一定的耐受性,其中加入N CuO时,DA101所占比例最高,说明DA101对N CuO有一定的耐受能力.而土样中的和在加入污染物后均有所降低.纳米颗粒对细菌的毒性作用,因菌种的不同而呈现一定的差异,这与细菌对纳米颗粒的敏感性有关.Yoon等[38]研究了大肠杆菌和枯草杆菌对Ag、Cu纳米颗粒的敏感系数,大肠杆菌的敏感系数小于枯草杆菌,表明大肠杆菌对Ag、Cu纳米颗粒的耐受性更高.PEX分别与N CuO和M CuO复合污染会使土壤中的细菌受到双重筛选的作用,同时,纳米颗粒与有毒有机物相互作用会放大对细菌的毒性[38],造成细菌群落结构较大的改变.

3 结论

3.1 N CuO较M CuO对土壤脲酶活性的抑制作用更明显,可能由于 N CuO破坏细菌的细胞膜或刺激细菌产生活性氧,造成细菌细胞的衰退,导致土壤脲酶的产生和分泌减少.

3.2 N CuO与PEX复合胁迫对土壤脲酶活性的影响与加入的物质浓度有关,低浓度时表现为拮抗作用,而高浓度时表现为协同作用.M CuO和PEX复合污染对土壤脲酶活性主要表现为拮抗作用.

3.3 加入不同的污染物质,土壤细菌的群落结构均发生了改变.N CuO、M CuO单一污染及与PEX复合污染均对土壤脲酶活性和细菌群落结构造成了不同程度的影响.N CuO对土壤脲酶活性及微生物群落结构的影响途径和毒性机制需进一步研究.同时,N CuO的复合污染可能会放大对土壤的毒害作用,因此土壤纳米颗粒的复合污染也应得以重视.

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Effects of different sizes of CuO and potassium ethyl potassium compound pollution on soil urease and microbial diversity.

XING Yi1,2, WANG Zhi-qiang1, LI Yi-fei1, HONG Chen1,3*, SHEN Qian1, YANG Qiang1

(1.School of Energy and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China；2.Beijing Key Laboratory of Resource-oriented Treatment of Industrial Pollutants, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China；3.Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy Science, Beijing 100085, China).

Copper oxide nanoparticles are different from the conventional copper oxide nanoparticles. Due to their small size, large specific surface area, copper oxide nanoparticles have potential hazards to the ecological environment. This study was done by adding different proportions of copper oxide nanoparticles (N CuO ) and copper oxide microparticles (M CuO)to the soil (0、50、200、800、1600mgCuO /kg dry soil) to observe their effects on soil urease activity and bacterial communities.Meanwhile, the effects of N CuO and M CuO with the compound pollution of potassium ethyl xanthate (PEX) on soil microbial biomass were studied, respectively. Compared with M CuO, N CuO have stronger inhibition on the activity of urease.Only when the concentration of M CuO was 1600mg/kg, the effect of M CuO on urease activity was obvious. The inhibition of urease activity by N CuO may be related to the destruction of the cell membrane or the stimulation of the bacteria to produce reactive oxygen species, which caused the decline of bacterial cells. N CuO also has a greater influence on the bacterial community structure. Combined pollution of N CuO and PEX increased the toxicity of N CuO to soil microorganism, the activity of urease decreased greatly and the community structure of bacteria also changed greater. The mechanism of N CuO and its combined pollution on soil microbes need to be further studied. By comparing the ecological toxicity of N CuO and M CuO, the ecological toxicity of nanoparticles must be given high attention.

copper oxide nanoparticles；copper oxide microparticles；potassium ethyl xanthate；Ureaseactivity；Microbial diversity

X53

A

1000-6923(2017)04-1466-08

2016-09-02

国家自然科学基金资助项目(41273091);科技北京百名领军人才培养工程资助项目(LJ201620)

邢 奕(1976-),男,山西太原人,教授,博士,主要研究方向为重金属土壤修复、固体废弃物资源化处置.发表论文120余篇.

* 责任作者, 讲师, hongchen000@126.com

, 2017,37(4)：1466~1473