杜 兰,张振轩,朱亚先,张 勇*



空间位阻对溶解态甲基菲生物降解的影响

杜 兰1,张振轩1,朱亚先2,张 勇1*

(1.厦门大学环境与生态学院,近海海洋环境科学国家重点实验室,福建厦门 361102；2.厦门大学化学化工学院化学系,福建厦门361005)

以菲(Phe)和甲基菲(MP:1-MP、3-MP、4-MP、9-MP)为研究对象,运用同步荧光法研究微生物US6-1对5种溶解态多环芳烃(PAHs)的降解特性.结果显示:MP在8×10-7,1.2×10-6mol/L2种浓度下,其生物降解过程符合零级动力学,降解速率均为:4-MP<9-MP<1-MP<3-MP;5种PAHs的最大生物降解速率同理论最大跨膜通量存在良好的线性关系;NaN3对Phe降解速率影响较小,但抑制MP降解且抑制程度与取代基位置有关.

甲基菲；同系物；生物降解；跨膜过程

菲(Phe)及其烷基取代物是石油中常见的有机污染物[1-2].烷基取代多环芳烃(A-PAHs)的毒性常常强于其母环PAHs,在环境中尤其是海洋溢油区,其含量显著高于其母环化合物[3-4].因此研究水环境中A-PAHs的污染及其去除十分重要.生物降解是去除环境中PAHs最为有效的手段之一[5-6].研究表明细菌对PAHs的降解多属于胞内反应,生物体内降解酶系是影响细菌降解PAHs的关键因素[7-8];PAHs进入细胞的途径是影响其降解的重要因素;而底物的位阻效应会干扰其与降解酶和膜转运蛋白的结合[9-10],进而影响底物的降解过程[11-12].取代基位阻效应对甲基萘生物降解影响已有报道[13-15].然而,目前关于溶解态A-PAHs尤其是3环及以上A-PAHs结构的差异对其生物降解影响的研究鲜见报道.

本文选取新鞘氨醇杆菌() US6-1为降解菌,以Phe及甲基菲(MP, 如1-MP、3-MP、4-MP和9-MP)为研究对象,运用同步荧光法研究上述目标物生物降解过程和跨膜机理,以期为评估PAHs在水环境中转化,归宿及风险性提供参考.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

Phe、1-MP、3-MP、4-MP和9-MP(纯度>98%,美国Sigma-Aldrich公司); (NH4)2SO4、Na2HPO4、K2HPO4、(NH4)6Mo7O24·4H2O、CaCl2·2H2O、NaOH、FeCl3·6H2O、MgSO4·7H2O (A.R.,国药化学试剂有限公司);无水乙醇(A.R.,西陇化工股份有限公司);富营养培养基:2216E(青岛海博生物技术有限公司),NaN3(纯度>99%,天津福晨化学试剂厂). MSM液体培养基的配制参照文献[16].

FLS 920型纳秒时间分辨荧光光谱仪(Edinburgh Instrument公司,英国);752紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);HV-50全自动电子灭菌器(Hiragama公司,日本);Universal 320R高速冷冻离心机(Hettich公司,德国); VS- 840K-U洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司); Sky 2102C恒温振荡器(上海苏坤实业有限公司).

1.2 实验材料

US6-1由韩国海洋研究与发展院提供,可降解芴, Phe,蒽和芘(Pyr)等PAHs[16].

1.3 实验方法

1.3.1 Phe及MP同步荧光法波长差(Δ)的选取 荧光法具有快速、灵敏和非破坏性等特点,已被用于检测生物降解过程中溶解态PAHs的浓度变化[17].分别称取一定量Phe、1-MP、3-MP、4-MP和9-MP标准品溶于乙醇,配制成1.0×10-2mol/L的储备液,置于4℃冰箱保存.取适量PAHs储备液于10mL比色管中,氮吹至近干后用MSM溶液定容至10mL,混匀并超声20min.分别扫描上述5种PAHs的荧光光谱,设置ex=220~340nm,em= 320~420nm;步距均为2nm;激发和发射狭缝均为2nm,确定5种PAHs的Δ和波长范围[17-18].

1.3.2 PAHs的生物降解实验 为考察US6-1对MP降解规律及其与浓度的关系,对5种PAHs在2种浓度条件下的降解过程展开研究.第1组PAHs浓度均为0.8×10-6mol/L,第2组PAHs浓度均为1.2×10-6mol/L.取适量上述PAHs储备液于125mL锥形瓶中,氮吹至近干后加入100mL MSM溶液.接种菌后于摇床中避光震荡培养(25℃, 150r/min)[16].适当时间后以1.3.1节方法直接测定降解体系中PAHs荧光强度.实验设3组平行.通过预实验发现,当降解菌初始生物量OD600=0.001时,降解PAHs效率高且实验现象明显,其余具体实验方法同1.3.1节.实验所用容器及培养液均经过高温高压灭菌20min.

1.3.3 最大生物降解速率 Phe浓度为5.0× 10-6mol/L,MP在浓度为1.2×10-6mol/L实验见1.3.2节.取降解菌初始生物量OD600=0.001,其余具体实验方法同1.3.1节.

1.3.4 PAHs跨膜方式的研究方法 为使5种PAHs在较短时间内降解明显,对照组和实验组中Phe和3-MP浓度为8×10-7mol/L,1-MP浓度为7×10-7mol/L, 4-MP浓度为3×10-7mol/L, 9MP浓度为5×10-7mol/L.取适量NaN3配置成5mol/L储备液,实验时取600mL储备液加入实验组降解体系,使其最终浓度为30mmol/L,OD600= 0.001.其余实验过程参考1.3.1节.

2 结果与讨论

2.1 Phe及MP同步荧光波长差的选取及其工作曲线

表1 同步荧光光谱法的分析特性参数

运用同步荧光技术,每隔1nm,分别考察Δ=45~65nm时Phe和MP的同步荧光光谱.结果表明Phe、1-MP、3-MP、4-MP和9-MP的最佳测定波长差分别为54,52,53,55,55nm.在各自最优条件下,分别扫描梯度浓度PAHs溶液的同步荧光,并以各自最大荧光峰处强度()对其浓度(,mol/L)作图.结果表明,一定浓度范围内5种PAHs的浓度(mmol/L)和荧光信号值呈良好的线性关系,其分析特性见表1.

2.2 空间位阻对MP生物降解影响

已有文献报道US6-1可降解苯并[a]芘[19]、Phe[20]、Pyr[20]等,关于其对MP降解未见相关报道.本实验结果显示(图1),US6-1不仅可降解Phe,还可有效降解MP.

对实验数据进行动力学拟合(表2).结果表明在0.8×10-6和1.2×10-6mol/L 2种浓度条件下,Phe及MP降解过程均符合零级动力学方程(2³0.9738),且其降解速率随浓度增大而增大.5种PAHs降解速率大小顺序为4-MP(位)<9-MP(位)<1-MP(位)<3-MP(位)≈Phe,其中3-MP的降解速率常数分别是1-MP、4-MP、9-MP的1.24、3.68、1.75倍,可见位取代的MP降解要明显慢于位取代的MP. Malmquist等[21]研究指出A-PAHs生物降解速率受烷基取代基位置的影响.俞頔等[22]分析了非溶解态烷基萘各异构体生物降解过程,证实了烷基萘在石油介质中的降解受控于异构体萘环上取代基位置.Wammer和Peters[23]研究了对溶解态甲基萘(MN) 异构体生物降解过程中发现类似的现象.结合本研究结果可知,a位取代的A-PAHs降解要慢于b位取代的A-PAHs.其原因可能是甲基取代基的空间位阻效应阻碍了MP与酶结合[10,24-25],致使其降解速率的减小.

表2 5种PAHs生物降解动力学参数

注:为PAHs降解时间(h);为MSM溶液中PAHs的浓度(mol/L).

2.3 空间位阻对跨膜过程的影响

芳香化合物如PAHs主要通过自由扩散进入细胞[11].近年来,研究发现革兰氏阴性细菌细胞膜上存在一些胞外蛋白参与调节吸收芳香化合物[14].Dimitriou-Cristidis等[15]指出,较于母环PAHs, A-PAHs生物降解速率下降是由于烷基取代基的空间位阻不仅影响基质与酶结合,还影响其跨膜过程. Bressler等[13]通过最大生物降解速率(max)与理论最大跨膜通量(max)的关系研究了16种溶解态有机污染物的跨膜过程与生物降解速率之间的关系.因此,为研究上述5种PAHs降解过程中跨膜作用,对表3中max和max进行线性拟合.

由图2可知,上述PAHs的max与max存在一定的相关性,表明跨膜过程是PAHs生物降解过程中的限速步骤[13,15].由于max是由与浓度梯度相关的公式推导得到,因此这5种PAHs进入US6-1属于被动扩散[15].另外,3-MP和4-MP偏离这条趋势线.根据已有研究指出位于回归线上的PAHs生物降解速率受跨膜通量影响,可认为回归线以上的3-MP跨膜方式不仅包括自由扩散还涉及其他过程,而位于线性回归以下的4-MP的降解不仅受跨膜的限制,还受酶转化的影响[13].

表3 5种PAHs生物动力学参数

注 :MP的max为表2中浓度为1.2×10-6mol/L时降解速率;max是根据文献Bressler[13]公式max=0.003×ow××WM-1/2计算得到; logow值由EPI Suite得到.

30mmol/L NaN3能抑制膜蛋白,短期内不会对酶活性产生影响[11,14].为进一步探究Phe及MP进入US6-1的方式,即烷基取代基的位阻效应是否改变了MP跨膜过程,分别考察了NaN3对Phe和MP生物降解过程的影响(图3).

由图3可知,前3h NaN3未影响Phe降解: 3h以内,Phe浓度相差±0.23×10-7mol/L;3.5h时,未添加NaN3Phe的剩余浓度为1.33×10-7mol/L,添加NaN3组则为1.77×10-7mol/L.因此,比较3h内NaN3存在和不存在条件下MP的降解状况[14],结果表明较于Phe, NaN3存在下MP降解受到抑制.可能原因是当NaN3存在时,膜蛋白被抑制,而MP进入细菌体内需膜蛋白参与,因此MP跨膜转运减少,导致MP降解速率减弱;Phe跨膜过程主要是自由扩散,不受膜蛋白影响,短期内降解不受NaN3影响[15].因此甲基取代基改变了PAHs跨膜方式:Phe主要是自由扩散,MP则需膜蛋白参与.MP受抑制程度与取代基位置有关:4-MP (19.0%)>9-MP(11.1%)>3-MP(5.52%)>1-MP(8.78%),结合2.2节MP各异构体降解快慢趋势,发现MP受NaN3抑制程度与其生物降解过程存在相关性.有类似研究报道烃的跨膜传输具有选择性且选择的次序与细胞对底物降解的偏好性相符[26].但通过现有的技术手段无法判断不同MP的膜上转运蛋白性质,相关研究有待进一步开展.

3 结论

3.1 Phe和MP同步荧光法线性范围分别为(0.08~6.00),(0.08~1.20)×10-6mol/L,2>0.9912,能够用于US6-1降解溶解态MP的过程研究.

3.2 菲环上不同位置的甲基取代基产生了不同空间位阻效应,进而影响MP异构体的生物降解,降解速率趋势为:4-MP(位)<9-MP(位)<1-MP(位)< 3-MP(位),位取代MP降解速率慢于位取代MP.

3.3 甲基取代基产生的空间位阻效应改变A-PAHs跨膜方式,且与取代基位置相关,进而影响其生物降解过程.生物降解过程涉及如代谢物,酶蛋白及膜转运蛋白等诸多因素,因此为更全面了解A-PAHs生物降解过程及机理,需进一步借助如蛋白质组学和代谢物组学进行研究.

[1] Billiard S M, Meyer J N, Wassenberg D M, et al. Nonadditive effects of PAHs on early vertebrate development: mechanisms and implications for risk assessment [J]. Toxicological Sciences, 2008,105(1):5-23.

[2] Hong W J, Jia H, Li Y F, et al. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and alkylated PAHs in the coastal seawater, surface sediment and oyster from Dalian, Northeast China [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2016,128:11-20.

[3] Mu J L, Wang J, Jin F, et al. Comparative embryotoxicity of phenanthrene and alkyl-phenanthrene to marine medaka () [J]. Marine Pollution Bulletin, 2014,85(2):505-515.

[4] 海婷婷,陈颖军,王 艳,等.民用燃煤烟气中甲基多环芳烃的排放特征 [J]. 中国环境科学, 2013,33(6):979-984.

[5] 杜丽娜,高大文.青顶拟多孔菌对单一和复合多环芳烃的降解特性[J]. 中国环境科学, 2011,31(2):277-282.

[6] 唐玉斌,王晓朝,陈芳艳,等.芴降解优势菌的筛选鉴定及降解特性研究 [J]. 中国环境科学, 2010,30(8):1086-1090.

[7] 刁 硕,王红旗,许 洁,等.低温耐盐芘降解菌的筛选鉴定及降解特性研究 [J]. 中国环境科学, 2017,37(2):677-685.

[8] 蒙小俊,李海波,盛宇星,等.焦化废水活性污泥 PAH 双加氧酶基因多样性分析 [J]. 中国环境科学, 2017,37(1): 367-372.

[9] 解宝玥,金利群,郑裕国,等.酰胺酶催化底物特异性的研究进展 [J]. 农药, 2012,51(7):473-477.

[10] 高兴军,郭 明,李 兵,等.二价金属离子与牛血清白蛋白的相互作用 [J]. 浙江农林大学学报, 2013,30(5):777-783.

[11] Bugg T, Foght J M, Pickard M A, et al. Uptake and active efflux of polycyclic aromatic hydrocarbons byLP6a [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(12):5387-5392.

[12] Chen B, Wang Y, Hu D. Biosorption and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in aqueous solutions by a consortium of white-rot fungi [J]. Journal of Hazardous Materials, 2010,179(1):845-851.

[13] Bressler D C, Gray M R. Transport and reaction processes in bioremediation of organic contaminants. 1. Review of bacterial degradation and transport [J]. International Journal of Chemical Reactor Engineering, 2003,1(1):1027-1043.

[14] Dimitriou-Christidis P. Modeling the biodegradability and physicochemical properties of polycyclic aromatic hydrocarbons [D]. Texas A&M University, 2005.

[15] Dimitriou-Christidis P, Autenrieth RL, McDonald TJ, et al. Measurement of biodegradability parameters for single unsubstituted and methylated polycyclic aromatic hydrocarbons in liquid bacterial suspensions [J]. Biotechnology and bioengineering, 2007,97(4):922-932.

[16] 吴 芳,朱亚先,张 勇,等.利用发光细菌测试方法评价菲和芘生物降解过程的毒性变化 [J]. 生态毒理学报, 2014,9(3):445-452.

[17] Zhang Z X, Zhu Y X, Zhang Y. Simultaneous determination of 9-ethylphenanthrene, pyrene and 1-hydroxypyrene in an aqueous solution by synchronous fluorimetry using the double scans method and hydroxyl-propyl beta-cyclodextrin as a sensitizer [J]. Talanta, 2015,144:836-843.

[18] 张 勇,朱亚先,权改劲,等.同步荧光法检测芘的微生物降解 [J]. 中国环境科学, 2002,22(4):289-292.

[19] Luo Y R, Kang S G, Kim S G, et al. Genome sequence of benzo (a)pyrene-degrading bacteriumUS6-1 [J], Journal of bacteriology, 2012,194(4):907-907.

[20] Yun S H, Choi C W, Lee S Y, et al. Proteomic characterization of plasmid pLA1for biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the marine bacterium,US6-1 [J]. PloS one, 2014,9(3):e90812.

[21] Malmquist L M V, Selck H, Jørgensen K B, et al. Polycyclic aromatic acids are primary metabolites of alkyl-PAHs-a case study with nereis diversicolor [J]. Environmental science & technology, 2015,49(9):5713-5721.

[22] 俞 頔,崔志松,沈冰芳,等.生物降解作用对烷基萘异构体分布的影响及其控制因素 [J]. 地球化学, 2014,43(2):149-156.

[23] Wammer K H, Peters C A. Polycyclic aromatic hydrocarbon biodegradation rates: a structure-based study [J]. Environmental Science & Technology, 2005,39(8):2571-2578.

[24] Zhong Y, Zou S, Lin L, et al. Effects of pyrene and fluoranthene on the degradation characteristics of phenanthrene in the cometabolism process bysp. strain PheB4isolated from mangrove sediments [J]. Marine Pollution Bulletin, 2010, 60(11):2043-2049.

[25] Luan T G, Kei S H, Zhong Y, et al. Study of metabolites from the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by bacterial consortium enriched from mangrove sediments [J]. Chemosphere, 2006,65(11):2289-2296.

[26] 刘 晔,牟伯中,刘洪来.烃的选择性跨膜传输 [J]. 微生物学通报, 2006,33(22):63-67.

Effect of steric hindrance on the biodegradation of dissolved methyl-phenanthrene.

DU Lan1, ZHANG Zhen-xuan1, ZHU Ya-xian2, ZHANG Yong1*

(1.State Key Laboratory of Marine Environmental Science of China, College of Environment and Ecology, Xiamen University, Xiamen 361102, China；2.Department of Chemistry, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, China).

The biodegradation of dissolved phenanthrene (Phe) and methyl-phenanthrene (MP), including1-MP, 3-MP, 4-MP and 9-MP by the bacteriumUS6-1was individually studied using synchronous fluorescence spectrometry. The biodegradation of MP was adequately described by zero-order kinetics at two concentrations, i.e., 8×10-7mol/L and 1.2×10-6mol/L. The rates of biodegradation were generally in the following order: 4-MP<9-MP<1-MP<3-MP. There was a good linear relationship between the measured maximum biodegradation rates and the theoretical maximum transmembrane fluxes. The addition of NaN3exerted little effects on the biodegradation of Phe but inhibited that of MP, with the degree of inhibition dependent on the position of the methyl substituent.

methyl-phenanthrene；isomer；biodegradation；membrane transport

X127

A

1000-6923(2017)04-1375-05

2016-08-23

国家自然科学基金资助项目(21177102,21577110);国家海洋局海洋溢油鉴别与损害评估技术重点实验室开放基金资助项目(201405);高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20130121130005)

杜 兰(1991-),女,安徽铜陵人,厦门大学硕士研究生,从事PAHs生物降解研究.

* 责任作者, 教授, yzhang@xmu.edu.cn

, 2017,37(4)：1375~1379