郑 涵,田昕竹,王学东,刘 彬,孟 楠,何 俊,陈世宝*



锌胁迫对土壤中微生物群落变化的影响

郑 涵1,田昕竹2,3,王学东2,刘 彬1,孟 楠1,何 俊2,陈世宝1*

(1.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所,农业部植物营养与肥料重点实验室,北京 100081；2.首都师范大学资源环境与旅游学院,北京 100048；3.北京市环境影响评价评估中心,北京 100161)

采用多聚酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)测试方法,对我国5种典型锌(Zn)污染土壤中的微生物进行了DGGE图谱分析,并通过戴斯矩阵方法和B-C矩阵2种方法对不同处理土壤中微生物群落相似性进行了测定, 结合Vegan排序轴分析方法对Zn胁迫土壤中微生物结构及群落相似性与土壤性质间关系进行了研究.结果表明:Zn胁迫会引起土壤微生物数目和种类的降低,但并不是简单的负相关.土壤中微生物的多样性指数最大值出现在低浓度(200mg/kg处理)污染程度土壤中,说明Zn 在低污染胁迫下,一定程度上会促进微生物群落数量的增加,丰富了群落结构多样性;高浓度(>800mg/kg)Zn胁迫对微生物群落结构有明显抑制作用,不同处理土壤微生物Shannon指数下降范围为5.14%(公主岭黑土)~17.2%(杭州水稻土). 通过戴斯矩阵分析土壤中微生物群落相似性结果表明,随着Zn浓度的增加,土壤中微生物群落相似性显著下降,最大降低23.3%,说明土壤中Zn胁迫在一定程度上改变了土壤微生物的群落结构.对土壤中影响Zn胁迫与微生物群落结构变化影响因子的相关性分析结果表明,影响微生物群落结构的主要因子为pH值>OC>CEC.

锌；PCR-DGGE；污染土壤；微生物群落结构；微生物多样性

近年来我国农田土壤锌(Zn)污染正以不同尺度的趋势快速蔓延[1-5],资料显示,我国Zn污染土壤超标率达0.9%.虽然我国最新颁布的食品安全标准中删除了Zn的限量标准值[6],但由Zn污染产生的生态环境风险已引起广泛关注.在土壤重金属污染防治的研究中,利用植物作为生态物种而进行的毒性测定及其相关机理研究较多[7-12],而针对土壤微生物群落的研究相对较少.土壤微生物群落被认为是土壤生态系统变化的预警及敏感指标,土壤中微生物对重金属污染胁迫产生的效应比同一环境中的植物和土壤动物更加敏感.Zn等重金属在土壤中难以降解,一方面导致微生物生物量降低,使得微生物群落结构稳定性遭受破坏[13];另一方面降低微生物生物活性,甚至抑制微生物的生长和代谢[14].且土壤微生物多样性会因其锌含量超标而大幅度降低[15].目前,土壤中微生物毒性测试被认为是评价土壤环境质量非常有潜力的生态毒理学指标[16].随着现代生物科技手段和分子技术水平的不断发展,利用土壤环境中微生物的群落结构和多样性变化作为受污染土壤毒理学测试指标已成为当前土壤环境科学研究的前沿领域之一[16-19].相对于传统的微生物分离培养方法,直接从土壤中提取微生物总DNA,从分子水平上研究土壤微生物的种类和种群结构变化与环境质量变化间的耦合关系, 可以很好地避免传统毒性测试方法在富集、培养、分离、研究的过程中造成微生物多样性的丢失,能够更全面、系统地认识土壤中微生物的多样性与环境质量变化的关系[20-21].多聚酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)测试方法作为一种DNA指纹技术,其原理是使用一对特异性引物PCR,达到扩增微生物群体16S rDNA的目的,产生包含长度相同但序列有异的DNA片段混合物,再用DGGE技术分离产物混合物来进行微生物种群和结构变化的一种测试方法[19,21-23].目前,将PCR-DGGE技术应用于测定污染土壤中Zn毒性对微生物种类及种群结构变化的研究还鲜见报道.

本研究选取我国5种具有代表性质的农田表层土壤,添加不同浓度的Zn,经过180d的培养老化后,利用基于16SrDNA的PCR-DGGE指纹图谱分析技术,对土壤中微生物群落结构进行测定,同时对Zn污染胁迫与土壤微生物结构多样性产生的影响、土壤微生物群落结构多样性和相似性的变化及其影响因子进行研究,以期为不同性质Zn污染土壤的毒理学评价提供基础数据,同时为锌污染土壤的生态风险评价和环境质量标准修订提供参考.

1 材料与方法

1.1 土壤采集及制备

依据我国土壤pH值及有机碳分布频率的地带性特征,采集了我国5个典型地点的耕作层土壤样品,分别为公主岭、广州、杭州、石家庄和海口,所有土样风干后过2mm的尼龙筛进行土壤基本理化性质的测定[24],见表1.

表1 供试土壤的基本性质

土壤采取外源添加Zn处理,添加方法如下:配置ZnCl2(分析纯)溶液,添加6个不同浓度梯度的Zn(mg/kg烘干土).分别为0、200、400、800、1600、2400mg/kg,每个Zn浓度3次重复,充分搅拌均匀,保持每种土壤的70%最大田间持水量(MWHC)平衡180d后,风干过2mm尼龙筛备用.PCR测试中样品编号信息见表2.

表2 样本编号

1.2 土壤中微生物的DGGE分析

1.2.1 土壤中DNA的提取[21]将不同处理的10-1~10-7土壤稀释度悬液涂布于R2A培养基,25 ℃培养10d后,将这些经过不同稀释度处理的培养基上的菌落,使用无菌水洗脱,并混合均匀.取1.5mL混合菌悬液,采用CTAB法提取土壤中微生物基因组DNA,保存于-20℃备用,每个稀释度3次重复.

1.2.2 土壤样品微生物的16SrDNA片段的PCR扩增[25]以样品基因组DNA为模板,采用细菌通用引物338F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGC- GGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518R(5’-GTATT- ACCGCGGCTGCTGG-3’)扩增样品16SrDNA高变区序列.

PCR扩增体系(50μL)为:10×PCR buffer5μL; dNTP(2.5mmol/L)3.2μL; rTaq(5U/μL)0.4μL; GC- 338F(20mmol/L)1μL; 518R(20mmol/L)1μL;模板DNA 50ng;补ddH2O至50μL.

PCR扩增程序为:94℃预变性5min;94℃变性1min,55℃复性45s,72℃延伸1min,30个循环;最终72℃延伸10min.PCR产物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收.

PCR仪为Biometra公司生产的T-gradient,凝胶成像仪为Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝胶成像系统.

1.2.3 PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析 取10μL PCR的产物进行变形梯度凝胶电泳(DGGE)分析.采用变形梯度为35%~55%、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶(化学变性剂为100%尿素7mol/L 和40%的丙烯酰胺)在1xTAE 缓冲液中150V 60℃下电泳5h.

变形梯度凝胶电泳(DGGE)完毕后、采用银染法染色、步骤如下:a)固定液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)固定15min;b) Milli-Q纯水清洗、20s和2min各一次; c)银染液(硝酸银1g、37%甲醛0.75mL、定容500mL)染色15min;d) Milli-Q纯水清洗、20s和2min各一次; e)显色液(氢氧化钠7.5g、37%甲醛2.5mL、定容500mL)显色5~7min;最后用终止液(乙醇50mL、冰醋酸2.5mL、定容500mL)终止反应.

1.3 主要电泳条带的回收与测序

用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带,采用OMEGA公司Poly-Gel DNA ExtractionKit回收目的条带.以2μL回收产物为模板,338F/518R 为引物进行PCR扩增.

PCR 扩增体系(50μL)为:10×PCR buffer 5μL; dNTP(2.5mmol/L)3.2μL; rTaq(5U/μL)0.4μL; 338F (20mmol/L) 1μL;518R(20mmol/L)1μL;模板DNA 1μL;补ddH2O至50μL.PCR扩增程序为:94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸30s, 30个循环;最后,72℃延伸10min.

将重新扩增的DNA 片段切胶回收、纯化后,连接到Pmd18-T载体上,并转化至DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆,进行序列测定.

1.4 数据处理

细菌多样性指数是研究群落物种数和个体数以及均匀度的综合指标.根据电泳图谱中样品条带数目及每个条带的强度(灰度),对各样品中细菌多样性指数()、均匀度()和丰富度()等指标进行分析.DGGE 图谱采用Quantityone软件对每个样品的电泳条带数目、条带密度进行数字化分析,香农指数()、丰度()和均衡指数()等指标被用来比较不同样品的多样性情况[25].其算法如下:

ln(1)

(2)

maxln(3)

式中:为样品中单一条带的强度在该样品所有条带总强度中所占的比率;为DGGE 图谱单一泳道上所有条带的丰度(%);为第条带的丰度(%);是某样品中所有条带数目总和.

测序结果采用DNAstar和Cluster软件进行序列分析,下载最相似的菌株序列作为系统发育树的参考序列.采用MEGA 软件,Neighbor-joining法构建系统发育树,自展数(bootstrap)为1000.

主成分分析(PCA)采用Canoco软件,根据DGGE条带配对图,在条带出现的地方定义1,未出现的地方定义为0,得到二次矩阵并进行主成分分析.

Bray-Curtis矩阵计算由R语言Ecodist包完成.绘制热图(Heatmap)采用R语言pheatmap包完成.排序轴分析由R语言Vegan包完成.

2 结果与讨论

2.1 土壤中Zn对微生物群落多样性的影响

以GC-338F和518R为引物扩增16S rDNA序列、得到约200bp的DNA片段用于DGGE分析.DGGE图谱上的条带数量和位置反映了土壤中菌群的多样性.从土壤微生物16S rDNA PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析图谱(图1)中可以看出,不同性质土壤中的微生物多样性有明显的差别;同一种土壤随着土壤中Zn浓度的增加,条带强度呈现先增加后减弱的趋势,带型也有区别,可见Zn污染胁迫对微生物群落结构有比较显著地影响.例如公主岭土壤Sample-2相对于Sample-1而言,条带数目减少,Sample-3相对于Sample-1、2出现了一些新的菌群,某些条带的强度有所增加,显示有一些微生物表现出了较高的耐性.据报道,土壤在受到Zn、Pb胁迫后,对某些菌类如固氮菌、木霉等菌类起抑制作用,但有些耐性较强的菌类如大豆根瘤菌反而会比无污染和污染较轻的土壤数量多.研究表明[17,20,26],在土壤微生物发生明显变化以前,整个微生物区系已经发生质的变化,无法适应的微生物种群数量下降,可以适应的微生物数量增加.理论上会有2种或2种以上更具耐性的物种来填补,从而丰富微生物系统.

表3 不同土壤中微生物多样性指数(H’)

注 :相同列的不同字母表示差异显著(<0.05).Cd(200mg/kg)、Cd(400mg/kg)、Cd(800mg/kg)、Cd(1600mg/kg) Cd(2400mg/kg)分别为Zn的6个不同浓度梯度,分别为0,200,400,800,1600, 2400mg/kg.

通过对不同土壤中微生物多样性指数(表3)分析发现,随着Zn浓度的逐渐增加,土壤中微生物多样性指数总体呈下降趋势,如杭州土壤(Sample- 7~12)中微生物多样性指数在最高Zn浓度时由对照的3.61下降到2.99,海口的土壤也由3.55下降到3.34,其他地区的土壤都呈现出相同的规律,表明Zn胁迫对土壤中微生物多样性有较强抑制;而在低浓度的时候各地区土壤微生物多样性指数均有升高的现象,比如广州水稻土的微生物多样性指数在Zn浓度为200mg/kg时(Sample-14),由对照(Sample-13)的3.55升到3.82.表明土壤中低浓度(200mg/kg)Zn会增加微生物群落多样性. 研究资料表明,土壤中重金属的胁迫会改变细胞代谢和微生物的功能,引起微生物生存力和竞争力的变化[27],从而导致种群大小的改变.因此,重金属胁迫会对微生物种群结构产生一定影响,但如果从微生物进化的角度及Zn作为生命必需元素来看,适当浓度的重金属反而对增加物种多样性,提高微生物的抗性有一定的积极作用.

表4 序列比对分析结果

对DGGE图谱中的15个主要差异条带进行回收测序,测序结果与Gen Bank中的序列进行比对,得到条带所代表的细菌类型.每个回收条带取3个克隆进行了序列测定,结果如表4,系统进化树见图2.由测序结果可知,大部分菌群为Proteobacteria变形菌门.

同时对土壤样品进行主成分分析,得到结果如图3.主成分分析可将不同土壤和对照分开,并且显示出不同样品之间的差异性.图中除石家庄褐土的Sample-19~24土壤处理外,同一土壤的微生物均较好的分布在一起.PCA-1和PCA-2代表总变量的29.8%,显示出不同样品之间有着较大的变异,如PCA-1可将杭州、广州及海口的样品明显地区分开,说明土壤中的微生物由于不同地域土壤性质的区别而有较大差异.

2.2 不同Zn处理土壤中微生物群落相似性分析

在计算不同Zn处理土壤的样本菌落结果相似度聚类分析时,通过间戴斯系数,得到各样本之间的相似性矩阵,利用UPGMA算法构建聚类分析图(图4),比较样本间的差异程度.

从样本相似性计算结果来看,在聚类图中,不同地区来源的样本基本可以较好聚在一起,说明微生物群落分布具有地域性差别.同时,在同一种土壤中,随着Zn浓度的增加,样本的相似性下降,根据聚类分析图,例如在杭州水稻土,Sample-10与Sample-12的相似性为95%, Sample-10与Sample-11的相似性只有59%,说明土壤中Zn胁迫显著改变了土壤中微生物的群落结构.

2.3 土壤理化性质对土壤微生物群落结构的影响

针对影响土壤中微生物群落结构变化的土壤性质,本研究采用Vegan包做了排序轴分析.结果表明,最大坐标长度为1.83<3~4(图5),因此该排序轴使用线性模型(PCA)较为合适,从图5看出,土壤pH、CEC、OC3种主要性质在二维排序轴贡献率约为60%.即可解释影响微生物分布差的约60%变量因素,且样本间距离分布符合样本相似性的计算结果.从各因子贡献率来看(表5),对样本微生物多样性影响最大的为pH值(CaCl2测定方法结果的影响略高于H2O测定方法),相关系数达到0.564,其次为OC(相关系数2= 0.503),再次为CEC(相关系数2=0.350),最后为Clay(相关系数2=0.214).可见不同地域土壤的理化因子对土壤中微生物群落结构有显著影响.

表5 土壤中微生物群落结构与土壤性质的相关分析

当重金属等污染物进入土壤后使得土壤中对污染物有耐性响应的物种变多,且微生物多样性降低,群落结构发生实质性变化.尽管现代微生物群落分析技术各有其局限性及偏差,但在一定程度上依然存在对群落结构因污染影响发生的变化进行很好地测定[28].本文采用PCR-DGGE指纹图谱分析方法,有效地对土壤中Zn污染胁迫与微生物种群结构的相关性进行了研究,因此利用PCR-DGGE指纹图谱分析方法对不同土壤样品中微生物多样性组成及其变化预测土壤生态系统风险具有一定的理论意义.

3 结论

3.1 通过对不同性质Zn污染土壤中的微生物PCR-DGGE图谱分析,表明Zn污染胁迫会引起土壤中微生物的数目和多样性的变化.总体来说,低浓度(<200mg/kg)Zn处理会一定程度促进微生物群落数量的增加,丰富了群落结构多样性;随着Zn浓度的升高,微生物多样性呈下降趋势,群落结构趋于简单.

3.2 通过戴斯矩阵方法和B-C矩阵方法比较土壤中微生物群落相似性,结果均表明不同地区来源的微生物群落分布基本在一起,说明微生物分布具有地域性差别.土壤中Zn胁迫明显改变了微生物的群落结构.

3.3 土壤中Zn胁迫对微生物群落结构变化的相关性分析结果表明,影响土壤微生物群落结构的主要因子为pH>OC>CEC.

[1] 李荣华,沈 锋,李晓龙,等.陕西某铅锌冶炼厂区及周边农田重金属污染土壤的稳定化修复理论与实践 [J]. 农业环境科学学报, 2015,34(7):1269-1276.

[2] 陈世宝,孙 聪,魏 威,等.根细胞壁及其组分差异对植物吸附、转运Zn的影响 [J]. 中国环境科学, 2012,32(9):1670-1676.

[3] 宋 伟,陈百明,刘 琳.中国耕地土壤重金属污染概况 [J]. 水土保持研究, 2013,4(15):922-930.

[4] 田昕竹,陈世宝,王学东,等.土壤溶液性质对Zn的形态变化及其微生物毒性的影响 [J]. 中国环境科学, 2014,34(10):2602-2609.

[5] 林 蕾,陈世宝,马义兵.土壤中锌的形态转化影响因素及有效性研究进展 [J]. 农业环境科学学报, 2012,31(2):221-229.

[6] GB2762-2012 中华人民共和国国家标准 [S].

[7] 李 季,黄益宗,胡 莹,等.基于植物重金属毒性的陆地生物配体模型(t-BLM)研究进展 [J]. 生态毒理学报, 2015,10(6):43-53.

[8] 陈世宝,林 蕾,魏 威,等.基于不同测试终点的土壤锌毒性阈值及预测模型 [J]. 中国环境科学, 2013,33(5):922-930.

[9] 何 俊,王学东,陈世宝,等.典型污灌区土壤中Cd的形态、有效性及其影响因子 [J]. 中国环境科学, 2016,36(10):3056-3063.

[10] Wang M, Chen L, Chen S B, et al. Alleviation of cadmium- induced root growth inhibition in crop seedlings by nanoparticles [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012,79:48-54.

[11] 李 宁,陈世宝.基于大麦根伸长测定土壤Pb毒性阈值、淋洗因子及其预测模型 [J]. 应用生态学报, 2015,26(7):2177-2182.

[12] Montiel-Rozas M M, Madejón E, Madejón P. Effect of heavy metals and organic matter on root exudates of herbaceous species:An assessment in sand and soil conditions under different levels of contamination [J]. Environmental Pollution, 2016,216:273-281.

[13] 张 妍,崔骁勇,罗 维.重金属污染对微生物生态功能的影响 [J]. 生态毒理学报, 2010,5(3):305-313.

[14] 王 嘉,王仁卿,郭卫华.重金属对土壤微生物影响的研究进展 [J]. 山东农业科学, 2006,1:101-104.

[15] Bruce F M. Zinc contamination decreases the bacterial diversity of agricultural soil [J]. Microbiology Ecology, 2003,43:13-19.

[16] Megharaj K V M, Sethunathan N, Naidu R. Bioavailability and toxicity of cadmium to microorganisms and their activities in soil: a review [J]. Advances in Environmental Research, 2003,(8):121-135.

[17] 邢 奕,司艳晓,洪 晨,等.铁矿区重金属污染对土壤微生物群落变化的影响 [J]. 环境科学研究, 2013,26(11):1201-1211.

[18] 罗 青,宋亚娜,郑伟文.PCR-DGGE法研究福建省稻田土壤微生物地区多态性 [J]. 中国生态农业学报, 2008,16(3):669-674.

[19] 阮菊俊.铜污染对土壤微生物活性的影响及其PCR-DGGE分析 [D]. 扬州:扬州大学, 2008.

[20] Broos K, Mertens J, Smolders E. Toxicity of heavy metals in soil assessed with various soil microbial and plant growth assays: as comparative study [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2005,24:634-640.

[21] 周海花.利用PCR-DGGE分析直流电场对土壤微生物群落的影响研究 [D]. 上海:东华大学, 2008.

[22] 李 晔,孙丽娜,杨继松,等.基于PCR-DGGE的重金属污染土壤微生物种群指纹分析 [J]. 生态环境学报, 2009,19(9):2204-2208.

[23] 郭飞宏,郑 正,张继彪.PCR-DGGE技术分析塔式蚯蚓生态滤池微生物群落结构 [J]. 中国环境科学, 2011,31(4):597-602.

[24] 鲁如坤.土壤农业化学分析方法[M]. 北京:中国农业科技出版社, 2000:12-19.

[25] Aydin S, Shahi A, Ozbayram E G, et al. Use of PCR-DGGE based molecular methods to assessment of microbial diversity during anaerobic treatment of antibiotic combinations [J]. Bioresource Technology, 2015,(192):735-740.

[26] 滕 应,骆永明,赵祥伟,等.重金属复合污染农田土壤DNA的快速提取及其PCR-DGGE分析 [J]. 土壤学报, 2004,41(3):343-347.

[27] 段学军,闵 航.镉对稻田土壤典型微生物种的胁迫生理毒性 [J]. 生态环境, 2005,14(6):865-869.

[28] 陈承利,廖 敏,曾路生.污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法[J]. 生态学报, 2006,26(10):3404-3412.

Effects of Zn pollution on soil microbial community in field soils and its main influence factors.

ZHENG Han1, TIAN Xin-zhu2,3, WANG Xue-dong2, LIU Bin1, MENG Nan1, HE Jun2, CHEN Shi-bao1*

(1.Key Laboratory of Plant Nutrition and Fertilizer, Ministry of Agriculture, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China；2.College of Resource Environment and Tourism, Capital Normal University, Beijing 100048, China；3.Beijing Environmental Impact Assessment Center, Beijing 100161, China).

The soil microbial structure and community of five different kinds of contaminated soil were determined using PCR-DGGE test method, the soil microbial community and microbial similarity was measured and compared using Des matrix analy sis and B-C matrix analysis and the relationship between Zn toxicity to soil microbial structure and soil properties was also analysed by using Vegan Sorting Axis analysis. Zn pollution could decrease the number and type of microbial in soil, while it was not a simply negative correlation. The maximum value of soil microorganisms diversity indices were observed at low Zn addition level (200mg/kg) in soils, which implied that application of low concentration Zn in soils would contribute to the increased number of soil microbial community and enrich the community structure diversity, however, with the increment of Zn in soils, the microbial community structure were restrained at high Zn concentrations, the Shannon index decreased 5.14% to 17.2% among the treatments, the minimum value (5.14%) was observed in black soil from Gongzhuling and the greatest reduction was found in the paddy soil from Hangzhou. The soil microbial similarity as determined by Des matrix and B-C matrix analysis decreased significantly with Zn addition in high concentration (>800mg/kg) in soils, with the maximum reduction of 23.3%, soil microbial community structure could be damaged after long time Zn stress in soils. Correlation analysis between the influencing factors of Zn stress and microbial community structure change in soils showed that the microbial community structure would be influenced by pH, followed by the OC, CEC in soils.

Zinc；PCR-DGGE；polluted soil；microbial community structure；soil microbial diversity

X171,X172

A

1000-6923(2017)04-1458-08

2016-08-26

国家支撑计划课题(2015BAD05B03);国家重点研发计划课题(2016YFD0800707);国家自然科学基金资助项目(41271490, 21077131)

郑 涵(1993-),女,山东潍坊人,中国农业科学院硕士研究生,主要从事农田重金属污染机制与修复研究.

* 责任作者, 研究员, chenshibao@caas.cn

, 2017,37(4)：1458~1465