邵红霞　万长亮（内蒙古精神卫生中心呼和浩特010010）



在线柱切换高效液相色谱法测定人血清中奥氮平、氯氮平和N-去甲氯氮平的浓度

邵红霞万长亮（内蒙古精神卫生中心呼和浩特010010）

摘要：目的：建立简单并能同时测定人血清中奥氮平、氯氮平及N-去甲氯氮平的血药浓度方法。方法：采用在线柱切换高效液相色谱法，紫外检测器检测，血清直接进样分析血清中奥氮平、氯氮平及N-去甲氯氮平的浓度。结果：奥氮平、氯氮平及N-去甲氯氮平均具有良好的专属性、线性、精密度、回收率和稳定性。结论：在线柱切换高效液相色谱法简单、准确，适用于奥氮平、氯氮平及N-去甲氯氮平血药浓度监测。此方法可以血清直接进样分析，省去了烦琐的预处理，同时保证检测的准确性。

关键词：奥氮平氯氮平去甲氯氮平高效液相

奥氮平是（clozapine）是临床常用的传统非典型抗精神病药，在体内吸收迅速，具有强大的镇静催眠作用。与经典抗精神病药相比极少见锥体外系反应。奥氮平（olanzapine）是在氯氮平的基础上开发的一种新型非典型抗精神病药，具有与氯氮平相似的化学结构和药理作用。但克服了氯氮平易引起粒细胞缺乏等不良反应［1］。非典型抗精神病药对精神分裂症的疗效已取得确认，但其药物代谢动力学特点及严重的不良反应，要求应用该类药物时采取个体化给药方案［2］。氯氮平和奥氮平均为血药浓度与药理作用具有相关性，血药浓度和靶组织的浓度具有显著相关且药动学个体差异大的药物，需要检测血药浓度作为调整给药方案的客观依据。N-去甲氯氮平（N-demethyl clozapine）是氯氮平在人体内的代谢产物，仍然有较强的药理作用，同时检测氯氮平和去甲氯氮平更能准确反映血药浓度与疗效的相关性。

氯氮平和奥氮平的血药浓度监测多采用离线前处理后再进行高效液相色谱法监测分析［3～4］，但是由于血清前处理过于烦琐，提取过程中容易乳化，人为干扰因素多，影响检测结果，本课题采用前处理柱（MAYI-ODS柱）联合在线柱切换高效液相色谱法，这种方法一方面省去了烦琐的预处理，另一方面避免生物样品在预处理过程中成分改变或损失而影响检测，使治疗药物监测更简单快捷，结果更准确。

1　材料

1.1试剂与试药：氯氮平标准品来源于中国药品生物制品检定所（批号：6104-71-8），N-去甲氯氮平标准品来源于SIGMA公司（美国，批号O253750），奥氮平标准品来源于多伦多化学研究有限公司（加拿大，批号：100323-200201）。奥氮平片来源于美国礼来公司，氯氮平片来源于江苏恩华药业股份有限公司。甲醇、乙腈来源于天津化学试剂二厂色谱技术开发公司，均为色谱纯。冰乙酸来源于天津市科密欧化学试剂开发中心，正丁胺来源于天津市光复精细化工研究所，均为色谱纯。

1.2实验仪器：日本岛津LC-20A高效液相色谱仪，岛津AUWIZOD型十万分之一天平，B600B型医用低速离心机（白洋离心机厂），XW-80A型旋涡混合器（江苏海门市麒麟医用仪器厂），BL6-180型超声波清洗机（上海比朗仪器有限公司），DH-101型电热恒温鼓风干燥箱（天津市中环实验电炉有限公司），GM-0.33II型隔膜真空泵（天津市腾达过滤器件厂）。

2　方法与结果

2.1对照品溶液的制备：精密称奥氮平、氯氮平、N-去甲氯氮平对照品分别5.02mg、5.00mg、5.01mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得0.5mg/mL母液。制得母液置于冰箱冷藏备用。

2.2供试品的制备：空白血清的制备，收集正常人（未服药物）的全血，经高速离心机离心，提取血清，得空白血清。精密吸取“2.1”项下各对照品溶液，加甲醇稀释成梯度浓度，奥氮平梯度浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0μg/mL，氯氮平梯度浓度为1.5、3、6、12、24μg/mL，N-去甲氯氮平梯度浓度为1.5、3、6、12、24μg/ mL。用上述梯度浓度的甲醇溶液加入空白血清，得到含有一定浓度药物的血清。

2.3色谱条件：本课题采用在线柱切换高效液相色谱法测定人血清中奥氮平、氯氮平及N-去甲氯氮平的浓度，柱切换高效液相色谱的结构示意图见图1，如图所示当六通阀（6-port valve）如图1中A图位置时，用自动进样器（Auto-sampler）血清直接进样，由流动相C将样品导入，流动相D将样品稀释后进入MAYI柱（MAYI Column），药物分子被MAYI柱保留，蛋白质等杂质不被保留而流入废液，当大部分药物被保留，而蛋白质等杂质被去除后，切换六通阀（由软件自动控制），切换后高效液相色谱的结构示意图见图1中的B图，由流动相A和流动相B组成的流动相反相经过MAYI柱，将保留在MAYI柱上的药物洗脱下来，后经色谱柱（Column）分离，检测器（Detecter）检测。色谱柱为SHIMADZU Shim-pack VP-ODS（150L×4.6，NO.5012023）色谱柱，流动相A为水︰正丁胺︰冰乙酸（v∶v∶v）=200∶3∶1，流速0.5mL/min；流动相B为乙腈，流速0.5mL/min；流动相C为水∶乙腈∶正丁胺∶冰乙酸（v∶v∶v）=200∶10∶1.5∶1.5，流速0.1mL/min；流动相D为水∶乙腈∶正丁胺∶冰乙酸（v∶v∶v）=200∶10∶1.5∶1.5，流速0.8mL/min。600μL血清直接进样，检测波长为254nm，切换时间为3min，保留时间：奥氮平保留时间为12.6min，氯氮平保留时间为8.7min，N-去甲氯氮平保留时间为6.7min。色谱图见图1。

2.4线性关系：按“2.2”项下制备供试品溶液，得到梯度浓度血清溶液，即奥氮平梯度浓度为4、8、16、32、64ng/mL，氯氮平梯度浓度为75、150、300、600、1200ng/mL，N-去甲氯氮平梯度浓度为75、150、300、600、1200ng/mL。血清600μL直接进样，记录色谱图，测得峰面积。分别以峰面积为纵坐标（Y），以血清药物浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程和线性相关系数：N-去甲氯氮平：Y=463.24X-1200.3，R2=0.9992；氯氮平：Y=361.05X-803.04，R2=0.9994；奥氮平：Y=907X-82，R2=0.9998结果表明，奥氮平、氯氮平、N-去甲氯氮平检测浓度分别在4～64ng/mL、75～1200ng/mL、75～1200ng/mL范围内呈良好线性关系。

2.5最低定量限：如以标准曲线最低浓度为最低检测限，血清中奥氮平、氯氮平和N-去甲氯氮平的最低定量限为2、15、15ng/mL。

2.6系统精密度和准确度：按“2.2”项下制备供试品溶液的三个梯度浓度即奥氮平、氯氮平、N-去甲氯氮平的血清浓度分别为4、16、64ng/mL，75、300、1200ng/mL，75、300、1200ng/mL。600μL血清进样，每天测定5次，连续测定5d，记录峰面积，考察日内、日间精密度。同法平行制备6份血清浓度梯度考察该方法回收率。结果见表1。结果表明该方法的日内精密度和日间精密度都符合药典附录生物样品定量分析方法验证指导原则的规定，变异系数低于15%，方法回收率结果一致、精密、可重现。

2.7样品稳定性试验：按“2.2”项下制备供试品溶液，制备奥氮平、氯氮平、N-去甲氯氮平的血清浓度分别为16、300、300ng/mL的血清溶液，在上述色谱条件下，分别在制备样品后的0h、1h、2h、4h、8h、24h进行测定，记录色谱图，结果如表2，样品峰面积的RSD分别为7.9%、4.2%、4.5%，说明样品于血清中24h内稳定。

2.8服药患者血清样品测定：选取服用奥氮平和氯氮平的患者各一例，晨时未服药前肘静脉采血5mL，离心取血清，按“2.2.3”项下色谱条件600μL血清进样，用外标法计算即得。奥氮平血药浓度为19.2ng/mL，氯氮平和N-去甲氯氮平血药浓度分别为375.9ng/mL和258.4ng/mL。

表1　精密度和回收率试验结果Tab1 Results of precision and recovery test

3　讨论

本研究采用Shim-pack MAYI-ODS预处理柱，它是以甲基纤维素涂覆固定的反相前处理柱，使用甲基纤维素修饰多空硅胶，并将其内表面以ODS修饰，外表面涂覆的甲基纤维素可防止蛋白质的吸附，而小分子通过与ODS基团间的疏水作用被内表面保留。柱切换技术连同高效液相色谱已经被广泛应用［5～8］，前处理柱连同柱切换技术，可以实现血浆等生物样品的直接进样，免去了样品人工预处理，预处理一般用乙醚等有机溶剂提取，易发生乳化现象，影响检测。本研究中的方法回收率结果偏差较大，可能是因为药物与血清中蛋白结合率偏高或药物与柱填料内表面有较低的亲和力导致，为获得高回收率，可以通过优化导入溶剂，削弱蛋白与药物分子间的结合，在线稀释也是改善回收率的有效方法。本研究采用同一个色谱条件测定奥氮平和氯氮平、N-去甲氯氮平，同一色谱条件测定多种药物在抗精神病药物血药浓度监测中十分常见［9～11］，免去了不同药物更换色谱条件的操作，省去了大量时间。

总之，本研究为氯氮平和奥氮平的血药浓度监测提供了简单、快捷、准确的方法，为临床合理用药、减少不良反应提供依据，有利于提高精神分裂症患者的生活质量。

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Simultaneous determination of olanzapine，clozapine and N-demethyl clozapine in plasma by on-line column-switching highperformance liquid chromatography

Shao Hongxia Wan Changliang（Inner Mongolia mental health center，Hohhot 010010，.）

Abstract：Objective：To establish a simple method for determining the concentration of olanzapine，clozapine and N-demethyl clozapine. Method：Simultaneous determination of olanzapine，clozapine and N-demethyl clozapine in plasma by on-line column-switching highperformance liquid chromatography with UV detector，and allows the injection of serum.Results：Olanzapine，clozapine and clozapine N-demethyl have good specificity，linearity，precision，recovery and stability in determination by HPLC.Conclusion：On-line columnswitching high performance liquid chromatography is a simple，accurate method and suitable for olanzapine，clozapine and N-demethyl clozapine concentrations monitoring in plasma. this method allows the injection of serum，eliminating the tedious pretreatment，at the same time ensure the accuracy of detection.

Key words：Olanzapine ClozapineHPLC

中图分类号：R96

文献标识码：A

文章编号：1672-8351（2016）06-0001-03