王 振张晓刚宋 敏邵海鑫

（1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020）

外用中药制剂治疗急性软组织损伤的动物实验研究现状及进展*

王 振1张晓刚2△宋 敏1邵海鑫1

（1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020）

具有镇痛、抗炎、消肿作用的外用中药制剂种类繁多，研究这些外用中药制剂有效性和药效学作用的动物实验方法多种多样，从不同的药效作用方面证实对急性软组织损伤的治疗作用。笔者对近年来此类实验的动物实验造模方法和实验观察指标进行文献整理与分析，发现目前的研究主要还集中在损伤证候评分、镇痛抗炎消肿作用验证、组织病理变化、血液流变学改变及生化因子影响等方面。随着现代分子生物学及细胞免疫学的飞速发展，从细胞及分子水平研究外用中药制剂治疗急性软组织损伤作用机制将成为未来研究的热点。

急性软组织损伤 外用中药制剂 实验研究急性软组织损伤主要的病理变化为损伤性无菌性炎症，局部损伤组织细胞坏死，毛细血管扩张，白细胞浸润，水肿及出血等。中医认为急性软组织损伤为筋肉、脉络损伤，瘀血凝滞局部，将其病机概括为“气滞与血瘀”并见，以活血化瘀、通络行气、消肿止痛为治疗原则。外用中药制剂治疗急性软组织损伤独具特色，临床疗效满意，常用的剂型有敷贴药、涂擦药、热熨药及熏洗湿敷药等。近年来对于急性软组织损伤的病理变化不断深入研究，对其发挥治疗作用的药物的作用机制也有了更精确的认知。现将有关外用中药制剂治疗急性软组织损伤的实验研究作一综述如下。

1 相关动物造模方法

1.1 打击法 多采用自制打击器，使用固定重量器物从特定高度做自由落体运动，或者使其距被打击部位相同的距离，以恒定加速度加速运动，确保以固定的冲击量反复作用于被打击部位，直至造模成功。潘洪平等用昆明种小鼠，将其右后足足掌向上置于桌面，然后用厚纸制成内径略大于200 g砝码，高10 cm的圆筒垂直放在小鼠足掌面上，再将砝码从圆筒顶部松手落下，打击足掌造成软组织损伤［1］。林彩霞等采用自制的软组织打击器，该打击器有一交叉橡皮管，可以将打击物升至一定高度，提供其足够打击量，使用时将家兔左侧卧位固定于打击器内，升高打击物至固定高度，对准被打击部位，使打击物重复打击被打击部位16次，直至肉眼所见被打击软组织出现淤血及肿胀［2］。

1.2 注射法 注射造模法包括将从自体心脏抽取的血液，或者某些化学物质（如二甲苯、醋酸溶液）以及异性蛋白（如新鲜鸡蛋清）、颗粒性异物（如角叉菜胶）等注射入软组织内，以造成组织血肿、发炎，模拟急性软组织损伤后组织肿胀、炎症。余潮平等通过动物自体心脏取血移位注射法制造大鼠足踝部肿胀模型，即先用注射器穿刺实验大鼠心脏抽血后即刻注入大鼠一侧下肢足踝皮下，致其足踝肿胀［3］。李驰荣等通过成功造模二甲苯致小鼠耳廓肿胀及局部注射角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型证实了散瘀止痛膏具有消肿作用［4］。

1.3 压迫法 压迫法造急性软组织损伤动物模型文献报道方法单一，所选实验动物及被压迫组织均要求严格，较为满意的压迫造模法目前未见新报道，仍旧选择动物兔，对其膝关节髌下脂肪垫进行适度压迫，以造成滑膜及脂肪垫损伤而成功造模。毕胜等用成年新西兰兔进行造模，使用水囊，内部连接压力传感器与骨内压测量仪，将水囊用夹具固定在膝关节前，提供固定的内部压力对兔髌下脂肪垫进行压迫，同时以相同的角度、频率、次数、天数屈伸被压迫膝关节，结束后取材进行染色，组织病理观察，证实该动物模型的膝关节滑膜和髌下脂肪垫符合急性挤压伤的临床表现［5］。

1.4 切割法 采用手术刀切割骨骼肌致小鼠软组织挫伤模型，观察用药后各组不同时间点损伤组织的愈合情况，分阶段进行标记并统计。雷波等选雄性ICR小鼠进行分组，备皮部位选在雄鼠膝关节外侧周围，用手术刀沿腓骨长短肌最饱满处进行横向切割，使其完全离断。然后各组相应进行用药，分别于第10日、20日处死一半雄鼠，进行取材肉眼及镜下观察，分4个愈合阶段并采用标记法统计愈合程度［6］。

2 观察指标的实验研究

实验者常采用局部观察评分及损伤指数评分法进行研究，以客观说明研究药物对损伤组织的治疗作用。章建华等于SD大鼠急性软组织损伤模型成功后，通过肉眼观察大鼠损伤局部用药后在不同天数的情况及活动度，参照文献报道的损伤症候评估法，对各组进行评分统计，得出随治疗天数的增加，各组损伤证候指数不断下降，同一时间点，阳性对照组与三黄软膏组损伤症候指数明显小于模型对照组及基质对照组，而阳性对照组与三黄软膏组之间无显著差异，证实三黄软膏具有治疗急性软组织损伤的作用［7］。魏优秀等建立急性软组织损伤大鼠模型后通过局部大体观察评分比较，得出治疗组第3、5、7天局部观察评分均优于对照组，表明治伤软膏外敷有助于急性软组织损伤症状及体征的改善［8］。

3 组织形态学观察研究

运用病理学相关技术，将损伤组织进行取材、烘干、包埋、切片染色等处理后，运用光镜或者电镜进行观察，研究损伤组织的形态变化。急性软组织损伤病理改变为损伤局部的组织变性、渗出、增生及细胞形态改变等。周钰等用自制打击器成功造兔急性软组织损伤模型后，分为4组，各组给予相应药物，给药结束后将损伤组织进行取材固定，包埋切片并染色，行光镜下的病理组织观察、评分比较，表明超声电导经皮透入微米活血镇痛散较超声电导物理治疗和微米活血镇痛散外敷，可更好控制损伤局部的炎症反应，加快胶原纤维合成与肌纤维组织修复［9］。何梦婕等分别使用砝码和哑铃造大鼠急性软组织挫伤模型，然后随机分为6组，各组分别用药5 d，用药结束后予以处死，取材损伤处肌肉组织，行病理学检查，评分统计，结果独一味巴布膏高、中剂量组对砝码和哑铃造成的软组织挫伤均有较好的治疗作用，光镜下这两组肌纤维出现断裂、变性、坏死的面积较小，肌纤维间毛细血管扩张、增生程度也较轻微，而炎症细胞浸润数量相比其他各组也较少［10］。

4 有关镇痛作用方面的实验研究

常用的有关镇痛作用方面的实验有热板实验、甩尾实验、扭体实验及直流电测痛阈法等。热板法是一个经典的筛选镇痛药物实验，将雌性小鼠放在（55±0.5）℃的热板上，通过测定小鼠接触热板开始到出现舔足反应的时间，计为热痛反应时间（痛阈），具有镇痛作用的药物能提高痛阈。刘志敏等将50只雌性小鼠随机分为5组，给药组将面积为5 cm2的高、中、低剂量那如-3巴布剂贴于已净毛的背部皮肤上，阳性对照药组贴伤湿止痛膏，空白对照组不贴药物；通过贴药前后各组的平均痛阈值比较以及计算各组疼痛抑制率，证实了那如-3巴布剂具有明显的镇痛作用［11］。滕忠等选取痛阈符合实验要求的昆明种小鼠进行随机分组，给药部位为小鼠的下半截尾巴，给药结束后间隔30 min，选择功率合适的光热致痛仪距离尾部一定高度给与刺激，分别测给药结束后30、60、90、120、150 min各时间点痛阈值进行统计，证实了济民风湿王有良好的镇痛作用［12］。朱丽等采用腹腔注射醋酸溶液致小鼠急性腹膜炎模型，即采用小鼠扭体实验，成功证实了栀黄巴布剂对疼痛的治疗作用［13］。都兴东等先检测出动物痛阈值，在家兔右前肢安装含有饱和氯化钾溶液的电极，无关电极浸0.9%氯化钠注射液固定于对测肢体，用直流电对皮肤做痛刺激，测痛仪测3次取其均值为痛阈值。对比各组给药前后痛阈值变化，证实了威驰搽剂具有良好的镇痛作用，其优于红花油组［14］。

5 抗炎、消肿实验研究

抗炎消肿实验常用新鲜鸡蛋清、角叉菜胶以及某些化学物质（如二甲苯、醋酸溶液）等作为致炎因子制造炎症模型进行研究。王彦礼等对分组大鼠于末次给药后1 h用1%角叉菜胶使足跖致炎，然后计算致炎成功后不同时间点各组的肿胀率和抑制率，证实萸连巴布剂有明显的抗炎消肿作用，其持续时间长于口服萸连片［15］。姜慧婷等于各组给药结束后，间隔2 h，将浓度为0.5%的伊文思蓝溶液从尾静脉注入0.01 mL/g；紧接着腹腔注射浓度0.5%的醋酸溶液0.02 mL/g，结束后间隔30 min，再处死各组动物并收集腹腔冲洗液过滤，选取0.9%氯化钠注射液作为对照，分别将过滤后所得溶液和生理盐水置于590 nm处检测吸收度，将各组所得数据进行统计分析，证实伸筋活血合剂可抑制小鼠腹腔毛细血管通透性得增强［16］。何迅等将药物涂抹于相对应的各组大鼠的左后足，次日洗去残留药物后再次涂抹药物，给药结束后，间隔60 min于每组大鼠的左后足跖处，用新鲜鸡蛋清+0.9%氯化钠注射液溶液致炎，分别测注射蛋清后30、60、120、180、240、300 min的大鼠左后足体积，对照致炎前所测正常足体积，计算足肿胀率，通过统计分析可知紫金透骨喷雾剂高、中剂量组在注射蛋清溶液致炎后60～240 min这段时间对抗肿胀炎症作用最明显［17］。

6 血液流变学实验研究

通过测量受损局部微小血管血流速度，血流量大小及血液黏稠度和红细胞压积等进行研究。孟宪军等用扶他林涂抹作为对照组，通过观察红细胞变形指数、全血黏度及血浆黏度等，证实了川花膏对急性软组织损伤的治疗作用，可降低血液黏稠度，改善血液循环，在损伤早期疗效显著［18］。毛威等利用血液流变学进行动物检测，在研究舒经化瘀活络法治疗急性软组织损伤疗效观察的实验中，分别在用药1个疗程后，对比治疗组与对照组的血浆黏度、红细胞比容、红细胞沉降率及纤维蛋白原等血液流变学指标，结果治疗组各项指标血清水平均明显低于对照组，提示舒经化瘀活络法治疗急性软组织损伤可改善血液流变性，加快损伤组织修复［19］。张根印等通过检测血液流变学指标作为研究苏栀消肿膏药效的方法，结果该药可明显降低损伤局部血球压积及纤维蛋白量等血液流变学指标，降低血沉及血沉方程K值，并有效抑制血栓长度，从而改善大鼠血液高黏、高浓、高聚及高凝状态［20］。

7 损伤有关生化因子实验研究

查阅大量研究急性软组织损伤引起的炎症及损伤组织修复过程的文献报道可知，在软组织损伤引起的炎症反应及之后损伤组织的修复过程中，会有大量的炎性介质和细胞因子参与其中，并且发挥重要作用，主要包括前列腺素E2（PGE2）、白细胞介素（IL-1β、IL-6）、一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、损伤修复因子（bFGF mRNA）及水通道蛋白-3（AQP-3）等。

机体损伤后，局部损伤细胞将释放大量的化学介质，当这些化学介质作用于外周痛觉感受器，便可将其激活，使其致敏，导致原本痛阈值较高的感受器阈值下降，形成外周敏感化［21］。PGE2便是这些化学介质中的一种，它能够作用于外周感觉神经末梢EP受体，使其激活，敏化外周痛觉感受器，使痛阈值降低［22］。蒋伟冬等用ELISA法测定足趾肿胀组织中PGE2含量，RTPCR法测定足趾局部组织中COX-2 mRNA的表达，结果与0.9%氯化钠注射液相比，散瘀止痛方可抑制大鼠足趾肿胀度，降低PGE2含量及抑制COX-2 mRNA的表达，发挥抗炎作用［23］。

IL-6是一种多功能的细胞因子，通过与靶细胞表面的特异性受体（一种由IL-6R和信号传递亚单位糖蛋白130（gp130）所组成的复合受体）结合，而发挥其生物学功能［24］。IL-6产生后可直接参与到局部的炎性反应和炎症的损伤过程之中，刺激细胞生长、促进细胞分化，可促进B细胞活化增生分化成为浆细胞，提高免疫球蛋白的合成数量；促使T细胞增殖、刺激细胞毒性T细胞反应；诱导肝细胞合成急性期蛋白；加快造血干细胞从G0期进入到G1期，促使巨噬细胞、单核细胞和粒细胞增殖［25-26］。IL-1也是一种重要炎性介质，其来源于巨噬细胞，分为α、β两类，其中IL-1β是IL-1的主要分泌形式［27］，是炎症反应的内生介质。当机体组织损伤时，通常会出现IL-1持续异常增高。TNF-α是由活化的巨噬细胞、单核细胞、T淋巴细胞产生的一种具有许多生物活性的细胞因子，能够诱导中性粒细胞聚集，且对中性粒细胞和巨噬细胞的增生、成熟和活化发挥调节作用，同时对其黏附、游走和脱颗粒起促进作用，更进一步刺激单核细胞以及血管内皮细胞等产生细胞因子，引发级联反应，最终致组织发生炎症损伤［28］。魏国俊等通过对比损伤组织内IL-6与TNF-α含量差异，证实骨刺消巴布剂可通过调节组织内 IL-6、TNF-α水平而抑制无菌性炎症［29］。刘志敏等建立大鼠佐剂性关节炎 （AA）模型，ELISA法测定大鼠血清PGE2、IL-1、TNF-α水平，结果那如-3巴布剂对AA模型大鼠和弗氏完全佐剂（FAC）所致的继发性炎症模型大鼠的炎症均有明显抑制作用，各观察时间点，大鼠血清IL-1、TNF-α和PGE2水平较模型组均下降［11］。

董静等在各组治疗结束后的第1、3、5天取材，测定组织中NO和SOD含量进行组间比较，证实伤科止痛膏使炎症组织中SOD活性增高，自由基NO含量降低是其发挥疗效的作用机制之一［30］。罗毅文等采用复方西红花膏外用涂抹治疗大鼠臀部急性钝挫伤，发现其通过促进损伤处成纤维细胞的凋亡来加快组织修复，且可能与损伤组织bFGFmRNA表达升高有关［31］。

AQP-3是水通道蛋白家族中的一员，是一种疏水性细胞膜蛋白，能够对水-甘油共同进行转运。Wakayama等从基因和蛋白水平证实了AQP-3存在于人骨骼肌中，其表达主要位于骨骼肌细胞膜的内表面［32］。邵先舫等于各组用药后不同时间点，对损伤骨骼肌中的AQP-3mRNA及AQP-3蛋白表达水平进行检测统计分析，结果在3 d、5 d、7 d这3个检测时间点，药物组其AQP-3蛋白表达水平最高，模型组其次，正常对照组各个时间点均无明显改变，与各组在不同时间点骨骼肌组织含水量变化对比，两者趋势基本一致，说明AQP-3的高表达与肌肉含水量有关，骨骼肌组织损伤后，高表达AQP-3可促进损伤组织水肿消退［33］。

8 小 结

西药对于急性软组织损伤的治疗，虽然能迅速发挥其抗炎、镇痛作用，但是副作用较大，如胃肠道反应、溃疡等［34-35］。外用中药制剂治疗急性软组织损伤独具特色，临床疗效满意，其给药方式属经皮给药，避开肝脏首过效应，减少了毒副作用；同时避免影响药物吸收的各种胃肠道影响因素；确保局部血药浓度平稳，且随时可以终止给药。文献报道外用中药制剂治疗急性软组织损伤的作用机制主要有提高痛阈发挥镇痛作用；对炎症反应中炎性细胞的渗出、浸润进行抑制以及对炎性介质的合成与释放或者参与损伤修复的细胞因子、通道蛋白进行调控发挥抗炎修复作用；促进机体新陈代谢与增生病变的转化吸收，加快组织创伤的恢复及改善损伤部位微循环、血液流变学性质，降低毛细血管通透性等发挥治疗作用。

外用中药制剂治疗急性软组织损伤的实验研究目前主要还集中在病理学和组织学观察上，多从其药效学着手研究，近年从细胞生物学以及分子生物学角度对软组织损伤机制和药物作用机制的研究逐渐增多，随着细胞生物学和分子生物学的飞速发展，研究外用中药制剂治疗软组织损伤过程中参与到局部炎症反应、细胞增殖分化和组织修复重建的蛋白、分子、细胞及其作用机制将是研究者们今后研究重点。

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甘肃省中药现代制药工程研究院开发项目（2305145104）

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R285.5

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1004-745X（2016）11-2104-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.11.028

（2016-04-10）