李赛群 陈钰莹 廖 玲 周有君 杨 纯 潘 江 章 薇

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

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线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型的体会*

李赛群 陈钰莹 廖 玲 周有君 杨 纯 潘 江 章 薇△

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型被普遍认为是标准局灶性脑缺血动物模型，具有无需开颅、损伤小、可重复、缺血时间可控、梗阻部位较明确、脑缺血损伤程度较稳定等优点而被广泛应用于缺血性脑血管疾病的研究。笔者结合实际操作经验和既往的文献报道，对线栓法制备大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型谈几点体会，以供同仁参考。

动物模型 线栓法 大脑中动脉闭塞再灌注

近年来，缺血性脑血管疾病成为严重危害现代中老年人健康的疾病之一，而利用动物模型探索缺血性脑血管疾病发病的可能机制，努力探寻本病的有效治疗方法和药物是现代医学研究亟待解决的问题。建立一种最接近人类脑缺血的理想脑缺血模型对于研究脑缺血病理机制和防治措施有着重要意义［1］。线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R）模型被普遍认为是标准局灶性脑缺血动物模型［2］，具有无需开颅、损伤小、可重复、缺血时间可控、梗阻部位较明确、脑缺血损伤程度较稳定等优点而被广泛应用于缺血性脑血管疾病的研究。现笔者结合实际操作经验和既往的文献报道，对线栓法制备大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型谈几点体会，以供同仁参考。

1 动物的选择

1）动物品系。啮齿类动物鼠、兔、狗、猴等均可以用于线栓MCAO的制作。因该类动物与人类有相似的中枢神经系统解剖结构及卒中后病理生理改变，其中，大鼠基因与人类的基因有98%的同源性，还有具有廉价易于购买、种系内纯性好、同系大鼠间遗传差异小、有较强的抗感染能力、生命力强和成本低等优点，被广泛应用于脑缺血的研究。有研究者发现［3］，雌激素具有神经保护作用，故该模型多选用雄性的大鼠。常用的有SD大鼠和Wistar大鼠，Markgmf等［4］用光化学法脑缺血模型比较了这两种大鼠的梗死情况，发现SD大鼠梗死体积大于Wistar大鼠，且变异较小。此外，国内学者也发现SD大鼠生命力旺盛、颈部血管显示清晰，易于手术操作，手术中出血少，动物模型成功率高［5-6］。因此对于脑缺血模型的选择SD大鼠优于Wistar大鼠。2）体质量和鼠龄。目前多主张大鼠体质量控制在250～300 g。体质量和鼠龄过小，大鼠的血管偏细，造模时鱼线不容易插入，且鼠龄越小，大鼠对造模手术的耐受性差，术后容易死亡；体质量超过300 g的大鼠血管增粗，鱼线不能充分阻断血流而导致造模不成功。

2 术前准备

1）术前饮食。对于术前的饮食，国内的主流观点是术前禁食不禁水［7-8］，而笔者在研究中发现，大鼠在造模手术完成后前3 d，精神状态较差，饮食量很少，术后容易出现营养不良使死亡率提高。有学者也发现脑对缺血再灌注损伤的耐受程度与术前体内的葡萄糖浓度密切相关［9］，葡萄糖浓度低于正常水平可导致缺血再灌注动物的神经元损伤加重。故笔者主张术前后予自由摄食，可提高大鼠对缺血再灌注的耐受能力，减少术后死亡率。2）麻醉药物的选择。常用的麻醉药物有水合氯醛、乙醚和巴比妥类等，因乙醚麻醉难以控制造模动物的麻醉深度和时间，作用时间较短，需持续给药，并且挥发的气体对呼吸道有明显的刺激，一般不宜选用。戊巴比妥钠［10］对呼吸中枢有较强抑制作用，容易引起喉痉挛和支气管痉挛而导致动物死亡，因此笔者在研究中采用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉，该麻醉药具有麻醉深度易掌控、麻醉剂量小、副作用小、易于操作、价廉、配制储存简便易行的特点。麻醉剂的使用过程中应该注意以下几点：第一，严格按比例现配现用，并注意避光保存；第二，在抓取大鼠麻醉时，不能用力过度而导致大鼠不适挣扎，容易出现麻醉后死亡，尽量用柔和而又有效的力度抓取大鼠；第三，麻醉进针点选在大鼠腹直肌左侧0.5 cm的位置，尽量不要在腹直肌右侧进针，以防刺中右侧的肝脏；第四，按大鼠体质量给予麻醉剂量。由于水合氯醛的有效剂量和死亡剂量之间的区间很窄，故有研究人员提出首剂量可给予全剂量的4/5，以防出现麻醉后死亡。而我们发现，只要麻醉的时候大鼠无激烈的挣扎，按大鼠体重给予全剂量麻醉剂并未出现死亡，这样做的目的在于防止大鼠术后过度活动而影响鱼线的位置，甚至导致鱼线脱出而使造模不成功。若麻醉不完全，可根据麻醉的深度相应予以剂量，每次0.1～0.2 mL即可。

3 线栓的制备与插线的深度

1）线栓的制备。线栓是制备大鼠局灶性缺血模型非常关键的材料，线栓直径应与颈内动脉内径大小相适应才能最充分阻断进入大脑中动脉的血流。我们购买北京西浓科技有限公司的成品，鱼线是柔韧适度的单丝尼龙线，直径为0.26 mm，其头端烧熔为半球形，直径为（0.36±0.02）mm，表面光滑，易进入颅内又不至于刺破血管，前端20 mm包被多聚-L-赖氨酸，且不改变线栓的直径，线栓包被多聚-L-赖氨酸可以提高模型的稳定性，距离头端19～20 mm处做好标记，已消毒。购买成品鱼线使规格更为一致，对模型的影响因素更小。（2）插线的深度。Zarow等［11］采用体质量280～320 g SD大鼠，发现从颈内动脉（ICA）起始处进入深度22 mm，比进入18 mm能更可靠地产生神经功能障碍和缺血损伤。国内也有研究者［12］解剖证实250～300 g大鼠颈总动脉分叉处到大脑中动脉根部的距离约为13～14 mm。基于此，笔者最终采用的插入深度为从颈总动脉（CCA）分叉插入20 mm，即把标记送入分叉处，感觉有阻力时即停止插入，并向外稍拉出少许即可。此外，在插线时还应注意尽量固定一个实验人员来完成，以避免实验人员之间个体化的操作而造成模型之间的差异过大，保证模型的稳定性。

4 模型制备

1）手术器械。由于大鼠的神经和血管比较细，因此在造模时应选择精密度较高的手术器械，如剪血管时可以用眼科角膜剪，这种器械刀尖精小而又锋利，可在血管上剪合适大小的口子又能避免将血管剪断，可以很大程度上缩短手术时间，提高造模成功率。2）手术切口。手术的切口有颈部正中切口及颈侧部切口两种，我们在实际操作过程中发现：正中切口依次要经过颌下腺、颈部淋巴结、胸骨舌骨肌、二腹肌等，手术开口较深、视野受限，分离迷走、交感神经的难度较大，且对气管的机械刺激较大，而右侧颈部切口较正中切口更容易进行肌肉与血管的分离，手术视野暴露较好，出血少，对组织的损伤较小。由于左侧迷走神经直接分布于心脏，对心脏功能产生影响比较大，采用颈部右侧切口可减少脑外因素的影响［13］，因此我们不选左侧切口。3）线栓的插入位置与走向。主要有颈外动脉（ECA）插入和颈总动脉（CCA）插入两种，颈外动脉插入法难度较大，操作过程中容易将血管拉断，而颈总动脉插入法较前者易施行，手术操作简单、不刺激气管、对血管的机械刺激仅局限在颈总动脉，对生理结构的损伤小［14］，故我们选择颈总动脉插入法。结扎颈外动脉、颈总动脉近心端，并在颈总动脉远心端和颈内动脉各放一根活线，待鱼线插入后固定鱼线用，鱼线走向即从颈总动脉插入，经颈内动脉入颅，至大脑前动脉，再往回拉约2 mm即至大脑中动脉口，使线栓的标记刚好在颈总动脉分叉口处，记录开始脑缺血时间。4）缝合。由于术后需要再灌，故缝合的时候宜将多出的鱼线头埋在大鼠体内，不宜留在体外，因为麻醉不充分的大鼠术后过度活动有可能改变鱼线的位置甚至使鱼线脱出而导致造模失败。

5 术后再灌与护理

1）术后再灌。国内有研究人员［15］发现，术后24 h对不同灌注时间的MCAO大鼠进行评分，MCAO再灌注30 min和60 min未能引起小鼠明显的神经功能障碍，而再灌注90 min及120 min可引起小鼠明显的神经功能障碍，小鼠均出现对侧肢体瘫痪，主要是前肢；TTC染色显示：再灌注30～60 min仅形成很小的脑梗死灶，且梗死灶大小变异较大，而再灌注90 min和120 min小鼠脑切面均可见明显的苍白色梗死区，与正常的脑组织界线较明显，但前者梗死灶周围的半影区明显多于后者，其梗死灶的大小又明显小于前者，而且其恒定性明显差于后者，故我们选择脑缺血后120 min再灌。将大鼠仰卧位捆绑，剪开缝合的皮肤，将鱼线缓慢拔出1 cm左右，观察无出血后涂抹少量青霉素以预防感染，分层缝合伤口，对皮缝合好之后再用乙醇消毒2遍。2）术后护理。更换鼠笼垫料，再铺上无菌巾，将完成造模的大鼠置于鼠笼内，用烤灯照射直至大鼠完全苏醒。术后3 d内大鼠精神状态较差，自主活动较少，故可在鼠笼内放少量饲料，防止大鼠过度饥饿。每2日更换一次垫料，以保持鼠笼干燥清洁，减少环境造成的感染因素。

6 术后并发症与处理

MCAO大鼠常见的术后并发症有死亡、感染、癫痫、腹泻等。1）死亡。大鼠在术后24～48 h最容易死亡［16-17］，脑水肿是原因之一；另外，分离血管的时候损伤迷走神经容易导致大鼠窒息死亡；插线过程中用力过猛，刺破颅内血管导致蛛网膜下腔出血，血凝块广泛地凝结在软脑膜毛细血管表面，影响脑微循环也是导致死亡的原因之一。因此实验人员在造模过程中动作一定要轻柔，切忌用蛮力操作。2）感染。最常见的是眼部感染和尿路感染。眼部感染的大鼠可用红霉素眼膏外涂，每日1次，连续使用3～5 d可缓解；尿路感染的大鼠则可予腹腔注射青霉素4万U/只，每日1次，同时关注大鼠的饮水量，如自主饮水次数明显减少，可予1%的葡萄糖水灌胃，3～5 mL/只，每日2次。3）癫痫。其发生机制可能由于脑缺血后坏死的神经元过多，从而影响脑部神经元异常放电引发癫痫。对于癫痫的大鼠，我们均不纳入实验，及时予以麻醉处死。4）腹泻与消瘦。其产生可能与室温过低、亚低温损伤、感染等直接相关，可在大鼠饮用水内加入适量诺氟沙星抗菌治疗。腹泻时间过久的大鼠大多消瘦，可予1%的葡萄糖水灌胃补充营养，防止大鼠因营养不良而死亡。

7 结 语

大鼠中大脑中动脉闭塞再灌注模型是研究当下缺血性脑血管疾病的重要手段之一，随着研究的不断深入，其造模的方法也在不断改进和完善当中。由上文可知，线栓法制备大鼠大脑中动脉脑缺血模型也并非完美无缺，仍然存在一些局限性。如不同批次的大鼠的耐受性不同，同样的插线深度，有的大鼠会造模成功，出现神经功能缺损症状，而有的大鼠并无神经功能缺损症状等等。除此之外，MCAO大鼠模型造模手术属于精细手术，造模难度相对于其他手术偏大，术中容易出现各种操作不当而导致造模失败。因此，进一步完善MCAO/R模型的各个环节，使之更接近于人类脑血管发病过程，同时使得操作简单，容易复制、成功率高、模型稳定是我们今后应该深入研究的方向。

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Experience on Preparing the Model of Middle Cerebral Artery Occlusion and Reperfusion in Rats by Thread Embolism Method

LI Saiqun，CHEN Yuying，LIAO Ling，et al.

The First Affiliated Hospital of Hu-nan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

The occlusion reperfusion model of middle cerebral artery in rats is widely believed to be the standard focal cerebral ischemia animal model.It is widely used in ischemic cerebral vascular diseases with no need of craniotomy，little damage，controllable，controllable time of ischemia，definite obstruction site and stable cerebral ischemia.Based on the actual operation experience and previous literature reports，the author would talk about some experience in regard to the line bolt method to prepare the middle cerebral artery ischemia reperfusion model in rats for reference.

Animal model；Thread embolism method；Middle cerebral artery occlusion and reperfusion

国家自然科学基金项目（81273861，81473754）；湖南省教育厅科技项目（14C0852）

△（电子邮箱：507395550@qq.com）

R743

A

1004-745X（2016）11-2058-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.11.012

（2016-03-15）