氨溴索对胃内容物吸入性肺损伤JNK信号通路的影响

张衍民贾晓民赵杰李海泉马雷徐俊马杭文璐

(徐州医学院第二附属医院呼吸内科江苏徐州221006)

[摘要]①目的探讨氨溴索对大鼠胃内容物吸入后损伤肺组织中c-氨基末端蛋白激酶(c-jun N-terminal kinases，JNK)信号通路的影响。②方法40只健康Sprague-Dawley雄性大鼠随机分为4组：对照组、损伤组、SP600125(JNK特异性阻断剂)组、氨溴索组，每组10只；复制大鼠胃内容物吸入性肺损伤动物模型。检测各组大鼠肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞计数与丙二醛(MDA)活性、肺组织湿重/干重比(W/D)、髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性变化。Western-blot方法检测肺组织中JNK、磷酸化JNK(p-JNK)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表达；光镜下观察肺组织结构变化。③结果与对照组比较，损伤组BALF中性粒细胞计数与MDA活性、肺组织湿重/干重(W/D)比值以及MPO活性增加(均P<0.05)；p-JNK与iNOS蛋白表达均显著增高(均P<0.05)；肺组织出现明显病理组织学损伤。与损伤组比较，SP600125组和氨溴索组BALF中性粒细胞计数与MDA活性、肺组织W/D比值以及MPO活性下降，差异有统计学意义(均P<0.05)；p-JNK与iNOS蛋白表达均显著下降(均P<0.05)；肺组织病理学损伤减轻。Western-blot结果显示各组大鼠肺组织中JNK蛋白表达无差异。④结论JNK参与胃内容物吸入性肺损伤炎症反应，氨溴索可能通过抑制JNK信号通路、抑制iNOS表达发挥抗炎、抗氧化保护作用。

[关键词]氨溴索肺损伤JNK

[中图分类号]R 563

【作者简介】张衍民(1980-)，男，主治医师。研究方向：急性肺损伤发病机制。

【通讯作者】赵杰。

Effect of ambroxol inhalation lung injury of JNK signaling pathway in gastric aspiration lung injurZHANGYanmin,JIAXiaomin,ZHAOJie,etal(DepartmentofRespiratoryMedicineSecondAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,JiangsuXuzhou221006,China)

ABSTRACT[]ObjectiveTo investigate effect of ambroxol hydrochloride inhalation lung injury in tissue of c- N-terminal protein kinase signal pathway in Gastric Aspiration lung Injury.Methods40 healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups: control group,injury group,SP600125(JNKspecific inhibitor) group,ambroxolgroup,10 rats in each group;rat ofaspiration of gastric contents of lung injuryanimal model was remolded.Bronchoalveolarlavage fluidof rats(BALF) neutrophil count and malondialdehyde(MDA)activity,the lung wet weight /dry weight ratio(W/D),myeloperoxidase(Myeloperoxidase,MPOactivity changes.Detection of lung tissue Western-blot method of JNK and p-JNK(phosphorylated JNK)and inducible nitric oxidesynthase(iNOS)protein expression;observe the lung tissue structure changesunder light microscope.ResultsCompared with the control group,injury neutrophil count and MDA ingroup BALF(MDA)activity of neutral,lung wet weight/dry weight ratio,MPO activity increased(P<0.05)p-JNK and iNOS protein expression were significantly increased(P<0.05);lung tissue appeared obvious histopathological injury.Compared with the injury group,SP600125group andambroxol group BALF neutrophil count and malondialdehyde(MDA)activity,lung wetweight/dry weight ratio and the activity of MPO decreased,the difference was statistically significant(P<0.05);p-JNKand iNOS protein expression were significantly decreased(P<0.05);Damage of the lung tissue pathology was reduced.Western-blot results showed that thelung tissue of rats in each group were no difference in the expression of JNK protein.ConclusionJNK is involved in gastric contents inhalation lung injury and inflammation reaction,the protective effect of ambroxol on anti-inflammatory,antioxidant may be related to the inhibition of JNK signaling pathway and the inhibition of iNOS expression.

[KEYWORDS]Ambroxol.Lung injury.JNK

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)很容易发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，ALI/ARDS的发病及肺保护机制一直是重症呼吸关注的主要方面[1,2]。引起ALI/ARDS的病因是多种多样的，而胃内容物吸入作为化学性因素之一，在国外的报道中占发病的首位。呼吸专科医师面临着胃肠反流疾病、肥胖高腹压、醉酒状态及各种脑血管疾病发生后并发误吸、反流等引起的肺损伤问题。所以，积极探索胃内容物吸入性肺损伤发病及其保护机制有着重要的临床意义。

研究发现,c-氨基末端蛋白激酶(c-jun N-terminal kinases，JNK)作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路之一，在细胞外信号转导至细胞核的过程中起到重要作用，参与内毒素血症诱发的肺损伤细胞生物学炎症反应[3];氨溴索具有化痰、抗炎、抗氧化及促进肺表面活性物质合成等作用[4]，在胃内容物吸入性肺损伤中具有抗炎保护作用[5,6]。本研究旨在建立大鼠胃内容物吸入性肺损伤动物实验模型，进一步研究氨溴索对JNK信号通路蛋白表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物和主要试剂健康清洁级雄性SD大鼠，体质量250～300g(由徐州医学院实验动物中心提供)；氨溴索购于德国勃林格殷格翰公司；丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒由南京建成生化试剂公司提供；磷酸化JNK、p-JNK及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体、JNK抑制剂SP600125为Promega公司产品。

1.2模型的建立及分组SD大鼠40只，按随机数字表法分为4组，每组10只。对照组：实验动物仅进行气管插管，气道内给予等量生理盐水滴入。损伤组：采用Krishnan等动物模型[7]，使用3%戊巴比妥钠，50mg/kg体质量腹腔注射麻醉动物，给予14G静脉导管行气管插管术，通过气管插管向气道内滴入胃内容物(剂量为1.2mL/kg，成分包含40mg/mL胃食物微粒，pH值1.25；制备：取正常饲养大鼠予生理盐水灌胃，灌洗物通过薄纱滤过，将其pH值调定为1.25)。损伤发生后24h处死大鼠并取材。SP600125组：术前给予尾静脉注射JNK特异性抑制剂SP600125(3mg/100g),其余步骤同损伤组。氨溴索组：损伤发生后2h尾静脉注射氨溴索(50mg/kg)，其余步骤同损伤组。

1.3取材及制备标本开胸取出肺组织，取右上叶肺用于病理学检查；取右中叶肺称重；剩余右肺制成肺组织匀浆液：按每100mg肺组织加入0.9mLPBS(pH7.4)，在冰浴下用组织匀浆器制成10%肺组织匀浆。肺组织匀浆液分别于4℃、3000r/min离心15min，取上清于-80℃冻存。左肺予4℃生理盐水灌洗，灌洗回收率>85%；左肺组织充分漂洗后置于液氮中保存供蛋白免疫印迹法检测。

1.4检测指标与方法

1.4.1大鼠肺泡灌洗液(BALF)。中性粒细胞计数(WBC)。MDA活性检测按照试剂盒说明进行，并于最大吸收峰532nm处测定吸光度。

1.4.2肺组织湿/干重(W/D)比测定。取右中叶肺组织称重后置于烤箱中，70℃烘烤至恒重后称干重，计算肺组织W/D。

1.4.3肺组织MPO活性变化测定。用四甲基联苯胺法测定肺组织MPO活性，以每克组织中MPO活性单位(U/g)表示。

1.4.4Western Blot检测肺组织JNK、p-JNK、iNOS蛋白表达。自液氮中取出标本，迅速置于冰匀浆缓冲液中冰浴，用Teflon匀浆器高速匀浆(10s×6次)，800r∕min，离心10min，取上清为细胞蛋白提取液。按改良Lowry法测定其蛋白浓度，牛血清清蛋白为标准品。取相同蛋白量(100μg)的样品经10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，以半干电转移法转至硝酸纤维素膜上，电转条件2.5mA/cm2，电转时间50min；转移完毕，加入封闭液，室温封闭1h；封闭后，加入用封闭液稀释的一抗4℃孵育过夜；使用washing buffer〔10 mmol/L Tris(pH7.4)，0.1mol/L NaCl，0.05%Tween-20〕洗膜3次，加入荧光二抗(兔抗鼠IgG-AP)室温摇床上孵育2h；washing buffer洗膜后显色。结果使用Image软件半定量分析。

1.4.5病理学观察。取右上叶肺组织用10%甲醛固定，经石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色后，光镜下观察病理学变化。

2结果

2.1各组大鼠肺组织BALF中(WBC)、MDA活性、W/D比值、MPO活性比较与对照组比较，损伤组BALF中性粒细胞计数与MDA活性、W/D比值以及MPO活性增加(均P<0.05)；与损伤组比较，SP600125组和氨溴索组BALF中性粒细胞计数与MDA活性、肺组织W/D比值以及MPO活性下降，差异有统计学意义(均P<0.05),见表1。

表1　各组大鼠肺组织BALF中WBC、MDA活性、W/D比值、MPO活性比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与损伤组比较，#P<0.05

2.2各组大鼠肺组织JNK、p-JNK、iNOS蛋白表达Western-blot结果显示各组大鼠肺组织中JNK蛋白表达无差异；与对照组比较，损伤组中p-JNK与iNOS蛋白表达均显著增高(均P<0.05)；与损伤组比较，SP600125组和氨溴索组中p-JNK与iNOS蛋白表达均显著下降(均P<0.05)；见图1、图2、图3及表2。

图1JNK蛋白在对照组、损伤组、SP600125组、氨溴索组表达

图2p-JNK蛋白在对照组、损伤组、SP600125组、氨溴索组表达

图3iNOS蛋白在对照组、损伤组、SP600125组、氨溴索组表达

表2　各组肺组织JNK/β-actin和p-JNK/β-actin及iNOS/β-actin蛋白表达灰度比值

注：与对照组比较，aP>0.05，bP<0.05；与损伤组比较,cP<0.05

2.3病理学改变对照组肺组织无明显病理学改变，肺泡间隔正常，未见明显渗出、偶见少量炎性细胞；损伤组肺组织病理学改变明显，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔内可见渗出、炎性细胞及肺泡内出血表现；SP600125组与氨溴索组肺组织损伤较损伤组减轻，肺泡间隔有增厚但不如损伤组明显，肺泡内渗出减少，炎性细胞及肺泡内出血减少。见图4。

A. 对照组　B. 损伤组　C.SP600125组　D.氨溴索组

图4光镜下观察大鼠肺组织病理学变化(苏木精-伊红染色×100)

3讨论

氧化应激与炎症反应在胃内容物吸入性肺损伤的发生发展中发挥重要作用。急性损伤发生后中性粒细胞的“呼吸爆发”可产生大量活性氧自由基，多种炎症细胞因子、炎性介质、氧化应激因子的表达增多，同时机体抗氧化机制障碍存在，均会造成肺组织氧化/抗氧化系统严重破坏[8]。MDA是由氧自由基攻击生物膜中多不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物；肺组织W/D的变化可较好地反映肺间质及肺泡血管通透性改变的程度；肺组织中的MPO活性在一定程度上反映中性粒细胞在肺内的聚集程度。与对照组比较发现，损伤组中BALF中性粒细胞计数与MDA活性、肺组织W/D比值以及MPO活性均明显增加，说明胃内容物吸入后肺组织发生了明显的脂质过氧化等炎症反应。

研究发现,JNK作为丝裂原活化蛋白激酶的主要成员之一，可参与炎症信号转导[9]。iNOS是细胞信号转导的下游启动炎症反应的关键酶，在组织中大量表达会造成NO与ONOO-增多，作为强氧化剂损伤肺组织[10]。本实验条件下,各组大鼠肺组织JNK蛋白表达无差异，而损伤发生后p-JNK表达增多；与损伤组比较发现，应用JNK特异性抑制剂干预后p-JNK表达减少，同时BALF中性粒细胞计数与MDA活性、肺组织W/D比值以及MPO活性均下降；光镜下组织病理学较损伤组减轻；Western-blot显示SP600125组iNOS蛋白表达下降。上述说明：①JNK参与了胃内容物吸入后肺损伤炎症反应，其生物学活性是在其磷酸化状态下实现的；②抑制p-JNK表达在一定程度上可抑制胃内容物吸入后肺损伤炎症反应；③抑制p-JNK表达可减少iNOS蛋白表达。

氨溴索已不单纯作为化痰药物在临床上应用，研究发现大剂量氨溴索应用于ALI/ARDS治疗主要依赖于其抗氧化及抗炎作用[11]。本实验条件下，与损伤组比较，氨溴索组BALF中性粒细胞计数与MDA活性、肺组织W/D比值以及MPO活性下降；肺组织病理学损伤减轻；p-JNK与iNOS蛋白表达均显著下降。上述说明：①氨溴索在胃内容物吸入性肺损伤中具有抗炎性细胞聚集及抗脂质过氧化作用；②氨溴索可抑制p-JNK及iNOS蛋白表达。实验研究结果显示,在大鼠胃内容物吸入性肺损伤动物模型中，氨溴索可能通过抑制JNK信号通路减轻氧化应激反应发挥保护作用。至于氨溴索抑制JNK活化的确切分子机制，有待于进一步研究。

参考文献

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(2015-05-25收稿)(岳静玲编辑)

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