袁汇，赵淑萍，戴红英

(青岛大学医学院附属医院妇科,山东 青岛 266003)



宫颈癌及CINⅢ组织miRNA-34a表达及意义

袁汇，赵淑萍，戴红英

(青岛大学医学院附属医院妇科,山东 青岛 266003)

目的 探讨miRNA-34a(miR-34a)在宫颈上皮内瘤变(CINⅢ)及宫颈鳞癌组织和血清表达及其意义。方法 选择41例宫颈鳞癌病人(宫颈癌组)、27例CINⅢ病人(CINⅢ组)和20例正常宫颈者(对照组)，提取其血清及组织中的小分子RNA，采用实时荧光定量PCR方法检测miR-34a的表达。结果 宫颈癌及CINⅢ组织中miR-34a相对表达水平明显低于对照组，差异有显著性(F=70.26，q=8.36、16.58，P<0.01)。宫颈癌组血清中miR-34a相对表达量较CINⅢ组明显下降，差异有显著性(F=39.96，q=5.54，P<0.01)。CINⅢ组血清中miR-34a相对表达量较对照组也明显下降，差异有显著性(q=7.08，P<0.01)。宫颈癌组病人血清及组织中miR-34a的表达呈正相关(r=0.886，P<0.01)。结论 miR-34a在CINⅢ及宫颈鳞癌病人组织及血清中异常表达，可能在宫颈癌的发生和发展过程中发挥重要作用，对宫颈癌的诊断具有一定临床价值。

miRNA-34a；宫颈上皮内瘤样病变；宫颈肿瘤；聚合酶链反应

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤。近年来,宫颈癌的发病率逐年升高，发病日趋年轻化，严重威胁妇女健康和生命。研究显示，大量增高或降低的微小RNA(miRNA)在宫颈癌的发生发展中发挥着重要的作用[1]。已有研究表明，miRNA-34a(miR-34a)异常表达与多种肿瘤发生与发展相关，如非小细胞肺癌[2]、膀胱癌[3]、前列腺癌等[4]。本文旨在检测miR-34a在宫颈上皮内瘤变(CINⅢ)及宫颈鳞癌组织中的表达，探讨其在宫颈鳞癌发生、发展中可能的作用及其意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源

2013年1月—2014年4月，青岛大学附属海慈医院妇科住院宫颈鳞癌手术病人癌组织标本41例(宫颈癌组)，术前均未行放、化疗。病人年龄31～62岁，平均44.5岁。病理分级:G1级7例，G2级10例，G3级24例。按国际妇产科联盟(FIGO)的分期标准，Ⅰ期21例，Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期5例。CINⅢ病人的组织标本27例(CINⅢ组)，病人年龄28～51岁，平均39.3岁。另取同期年龄匹配的正常宫颈组织标本20例作为对照。所有标本均经有经验的病理医师明确诊断。清晨空腹时分别采集各组病人静脉血5 mL于真空干燥管中，以1 500 r/min离心15 min，吸取上层血清于洁净离心管中，然后置于-80 ℃冰箱保存待测。

1.2 研究方法

按照miRcute miRNA提取分离试剂盒使用说明书的步骤从组织及血清中提取总RNA。Beckman DU 800型紫外线分光光度计测定RNA提取液A260吸光度值，计算总RNA浓度。逆转录参照逆转录试剂盒说明书进行，首先对提取的总RNA进行逆转录，然后按照荧光定量PCR试剂盒操作说明操作,反应条件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 15 s，60 ℃15 s，进行40个循环。以U6为内参照，以去RNA酶的水模板为阴性对照，得到各模板的Ct值，然后用公式2-△△Ct计算各样本中miR-34a的相对表达量。每个样品重复实验3次，取均值。

2 结 果

对照组、CINⅢ组和宫颈癌组组织中miR-34a的相对表达水平分别为0.908±0.223、0.528±0.299、0.211±0.208，血清中miR-34a的相对表达水平分别为0.960±0.212、0.584±0.288、0.341±0.250。宫颈癌及CINⅢ组织中miR-34a相对表达水平明显低于对照组，差异有显著意义(F=70.26，q=8.36、16.58，P<0.01)；宫颈癌组和CINⅢ组组织中miR-34a相对表达水平差异也有显著性(q=8.30，P<0.01)。宫颈癌组血清中miR-34a相对表达量较CINⅢ组明显下降，差异有显著性(F=39.96，q=5.54，P<0.01)。CINⅢ组血清中miR-34a相对表达量较对照组明显下降，差异有显著性(q=7.08，P<0.01)。见表1。宫颈癌病人血清与组织中miR-34a表达呈正相关(r=0.886，P<0.05)。

3 讨 论

宫颈癌的发生发展常需要经历宫颈上皮内瘤变、原位癌、浸润癌等阶段，与HPV感染、染色体突变、单核苷酸多态性变化等密切相关，是一个多基因参与、涉及多步骤的复杂生物学过程[5]。多项研究表明，miRNA参与细胞增殖与代谢、分化与凋亡等生物学过程，miRNA主要通过与靶基因mRNA的3′-非翻译区的序列互补而在转录后水平调控靶基因表达，发挥着类似癌基因或抑癌基因的作用，与人类肿瘤发生和发展密切相关。

本研究结果显示，miR-34a 在CINⅢ和宫颈癌组织中的相对表达水平明显低于对照组，同时宫颈癌组与CINⅢ组miR-34a相对表达量比较差异也有显著性，表明随着宫颈癌的发生发展，miR-34a的表达逐渐降低，提示miR-34a很可能具有抑癌基因作用。近年来对miR-34a的相关研究逐渐增多，其抗肿瘤的作用机制也不断被揭示。miR-34家族普遍存在于哺乳动物中，其家族成员包括miR-34a、miR-34b和miR-34c，具有高度保守性。其主要功能包括诱导细胞凋亡、阻止细胞迁移及促使细胞周期停滞等[6]。作为家族中的一员，miR-34a的异常表达与多种肿瘤的发生与发展密切相关。p53作为一种抑癌基因已被广泛认知，近年来，越来越多的研究表明，p53与miR-34a关系密切。CASTRO等[7]的研究表明，miR-34a受到p53的直接调控，同时还以正反馈的方式调节p53活性，通过沉默信息调节因子1参与p53介导的细胞凋亡过程。研究证明，在肺癌、肾癌等多种肿瘤中miR-34a有异常表达，起到抑制癌症发生的作用。

目前，组织及血清中miRNA的表达和相对表达量的检测技术日趋成熟，而且血清中miRNA具有高度稳定性，具备疾病分子生物标志物的某些特点，使其作为恶性肿瘤的分子标志物成为可能[8-9]。刘秀琴等[9]的研究结果表明，miR-21过表达在急性B淋巴细胞白血病的发病中发挥着重要作用，可作为判断儿童急性B淋巴细胞白血病预后的指标之一。本文研究结果显示，组织及血清中miR-34a将为宫颈癌的早期诊断提供一个新的可供参考的指标，其可能具有的抑癌基因作用，有望成为宫颈癌新的治疗靶点。

[1] SIOMI H, SIOMI M C. Posttanscriptional regulation ofmicroRNA biogenesis in animals[J]. Mol Cell, 2010,38(3):323-332.

[2] 曾婷,郝丽,谢逸欣,等. microRNA-34a与非小细胞肺癌的关系及其可能调节机制[J]. 中国医药导报, 2012,9(23):5-7.

[3] WANG W, LI T, HAN G, et al. Expression and role of miR-34a in bladder cancer[J]. Indian J Biochem Biophys, 2013,50(2):87-92.

[4] LIU C, KELNAR K, LIU B, et al. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44[J]. Nat Med, 2011,17(2):211-215.

[5] TSUBOKURA M, KOMATSU T, KAMI M. The prevalence of high-risk human papillomavirus in women with different types of cervical cancer[J]. Ann Intern Med, 2008,149(4):283.

[6] YAMAKUCHI M F M, LOWENSTEIN C J. MiR-34a repression of SIRT1 regulatesapoptosis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008,105(36):13421-13426.

[7] CASTRO R E, FERREIRA D M, AFONSO M B, et al. miR-34a/SIRT1/p53 is suppressed by ursodeoxycholic acid in the rat liver and activated by disease severity in human non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Hepatol, 2013,58(1):119-125.

[8] LI B S, ZHAO Y L, GUO G, et al. Plasma microRNAs, miR-223, miR-21 and miR-218, as novel potential biomarkers for gastric cancer detection[J]. PLoS One, 2012,7(7):e41629.

[9] 刘秀琴,于树红,孙立荣. 急性B淋巴细胞白血病病儿miR-21表达及意义[J]. 齐鲁医学杂志, 2014,29(1):1-2,5.

(本文编辑 厉建强)

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF MIRNA-34A IN CERVICAL CANCER AND CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIA

YUANHui,ZHAOShuping,DAIHongying

(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo explore the expression of miRNA-34a and its significance in cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ (CINⅢ), squamous carcinoma of the cervix (SCC) and serum.MethodsForty-one patients with SCC (SCC group),27 with CINⅢ (CINⅢ group) and 20 with normal cervix (control group) were enrolled in this study. The small RNA was extracted from their serum and tissues for detection of miRNA-34a expressions using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).ResultsThe expression levels of miRNA-34a in CINⅢ and cancer tissues was notably lower than that in the normal control, the differences were significant (F=70.26;q=8.36,16.58;P<0.01). The serum level of miRNA-34a in the cancer was lower than that in CIN Ⅲ (F=39.96;q=5.54,7.04;P<0.01), that in CIN Ⅲ was lower than that in the normal control (q=7.08,P<0.01). In SCC patients, the expression levels of miRNA-34a in cancer tissue and in serum were positively correlated (r=0. 886,P<0.01).ConclusionThe abnormal expression of miRNA-34a in tissues and serum of CIN Ⅲ and cervical cancer is likely to play an important role in the occurrence and development of cervical cancer, which has a certain value in the diagnosis of this malignancy.

miRNA-34a; cervical intraepithelial neoplasia; uterine cervical neoplams; polymerase chain reaction

2015-02-22;

2015-04-30

袁汇(1975-)，女，博士研究生。

赵淑萍(1966-)，女，博士，教授，博士生导师。

R

A

1008-0341(2015)04-0457-02