北京北大维信生物科技有限公司（100094）马威 王晓峰 孟春玲 张丽梅 闫夏

我公司QC微生物实验室使用的黑曲霉孢子悬液主要用于基于《中华人民共和国药典》（以下简称《药典》）（2010年版一部）附录XIII C“微生物限度检查法”进行的微生物计数方法学验证及计数培养基适用性检查等，菌种是中国药品生物制品检定所医学保藏中心提供的冷冻干燥菌种“黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]”。《中华人民共和国药典》（2010年版 一部 ）附录XIII C“微生物限度检查法”中规定：“黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用”。为确定QC微生物实验室制备的黑曲霉孢子悬液的贮存期，以保证QC微生物实验室所用黑曲霉孢子悬液在贮存期内的质量符合要求，进行黑曲霉孢子悬液贮存期的确认。

1 风险分析

1.1 黑曲霉孢子悬液的质量可随贮存而变差，其生长能力、生长状态均可能变差而直接影响计数培养基的性能测试和质量控制、方法学验证结果的准确性。为降低风险，应对黑曲霉孢子悬液制备后和贮存期内的菌落计数及菌落形态进行确认。

1.2 《药典》规定工作菌种传代次数至少为第3代且不得超过第5代，当菌种代次超过第5代时，可能会出现菌种变异，所以第5代菌种属于“最差状况”，选取第5代菌种进行贮存期确认。

附表1 黑曲霉孢子悬液贮存期确认用培养基、稀释液

附表2 黑曲霉孢子悬液贮存期确认结果

2 实验准备

确认用仪器、设备经国家计量检测部门检定合格，并在有效期之内。确认用试验器具按规程清洁、灭菌后使用，且在有效期内。确认应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行，并为独立的阳性洁净区域。

3 确认用培养基、稀释液

黑曲霉孢子悬液储存期确认用培养基、稀释液见附表1。

4 确认用菌种

4.1 菌种 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]，是由中国药品生物制品检定所医学保藏中心提供的、保存于含有15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷冻管传代而得，以从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代。从0代传代至第5代，制成黑曲霉斜面。

附图 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]的菌落形态

4.2 工作菌种制备方法 用4.1中第5代黑曲霉斜面制备黑曲霉孢子悬液：取6支黑曲霉斜面，分别加入5ml含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，振荡60次，将孢子洗脱，过滤菌丝吸出孢子悬液至无菌试管内，即得[1]。

5 确认过程

5.1 “4.2”中孢子悬液制备的当日（第1天），将6支孢子悬液分别用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增稀释法稀释至10-7稀释菌液。将每支孢子悬液的10-5、10-6、10-7稀释菌液分别吸取1ml加入2个无菌平皿，分别注入15～20ml玫瑰红纳琼脂培养基，于25℃培养3天，对其菌落数进行点计并观察菌落形态。（稀释菌液使用后立即传出洁净区，置于2～8℃冰箱中存放）[1]

5.2 选取“4.2”中每支孢子悬液制备的当日计数结果为50～100cfu/ml的稀释菌液，即为考察用“含孢子数50～100cfu的黑曲霉孢子悬液”。将此悬液存放至第21天、第31天、第41天，分别吸取1ml加入2个无菌平皿，分别注入15～20ml玫瑰红纳琼脂培养基，于25℃培养3天，对其菌落数进行点计并观察菌落形态。（稀释菌液使用后立即传出洁净区，置于2～8℃冰箱中存放）[1]

5.3 可接受标准

5.3.1 制备当日的黑曲霉孢子悬液，计数同时观察菌落形态，菌落形态为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂质。菌落形态见附图。

5.3.2 制备当日计数结果为50～100cfu/ml的稀释菌液，在贮存期内计数结果不应有明显变化，且在50～100cfu/ml范围内；计数同时观察菌落形态，菌落形态结果应与第一天菌液经培养后的形态相同，为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂质。菌落形态见附图。

5.4 填写原始记录与贮存期的确定 储存期为黑曲霉孢子稀释菌液计数结果和菌落形态检查结果同时符合5.3规定的考察期限（21天、31天、41天）中最长的减去1天。

6 结果

黑曲霉孢子悬液储存期确定见附表2。

7 分析及结论

7.1 黑曲霉孢子悬液菌落形态：在黑曲霉孢子悬液制备后存放第21天、第31天、第41天培养后的菌落形态与黑曲霉孢子悬液制备当日的菌落形态相同，为：“黑褐色厚绒状，色泽均一，无杂质。”

7.2 菌落计数比较：使用Minitab（版本号：16）进行双样本t检验，比较第21天、第31天、第41天培养后的菌落计数与第1天的差异，发现：第1天、第21天无明显差异（无差异假设的P＝0.489）；第1天、第31天无明显差异（无差异假设的P＝0.779），第1天、第41天有明显差异（无差异假设的P＝0.027）。

7.3 黑-W-20101201-A2A1A1②A3A6的第21天、第31天菌落计数分别为42、44，低于下限50cfu/ml。但与第1天数值58差异较小，且t检验表明第1天、第21天、第31天总体无明显差异，可认为是由微生物计数操作偶然造成。确认结果表明黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]孢子悬液制备后存放至第21天、31天时其各项质量控制项目均符合规定。在2～8℃冰箱存放，存放有效期可定为30天。