杨丽华 李俞池 王旭亮 石 敏 江智茂 桂耀庭

北京大学深圳医院男性生殖与遗传重点实验室（深圳 518036）

·论 著·

剂量敏感的性别反转先天性肾上腺发育不良基因1与雄激素受体相互作用的研究*

杨丽华 李俞池 王旭亮 石 敏 江智茂 桂耀庭**

北京大学深圳医院男性生殖与遗传重点实验室（深圳 518036）

目的剂量敏感的性别反转-先天性肾上腺发育不良基因1（dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1, DAX1）和雄激素受体（androgen receptor, AR）在男性生殖系统中均发挥着不可替代的作用，以往研究证明二者之间存在某些联系，本实验主要检测DAX-1和AR蛋白在细胞内的相互作用情况。方法构建人的带HA多肽标签的DAX-1真核表达载体, 以脂质体方式将该质粒和雄激素受体真核表达质粒共转染至非洲绿猴肾成纤维细胞（COS-7）中，转染48h后收集细胞提取总蛋白，利用免疫共沉淀技术检测DAX-1和AR蛋白在细胞内的相互作用。结果成功构建了人DAX-1真核表达载体；免疫共沉淀实验结果显示DAX-1和AR蛋白在COS-7细胞内可以相互作用。结论DAX-1与AR蛋白在细胞内可能存在相互作用，为后续研究DAX-1功能、突变致病及DAX-1与AR的作用机制奠定基础。

基因, X连锁; 受体,雄激素; 男性泌尿生殖系统疾病

Key woorrddssGenes, X-Linked; receptors, androgen; male urogenital diseases

剂量敏感的性别反转-先天性肾上腺发育不良基因1（dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1, DAX1）是转录因子核受体家族的成员，由470个氨基酸组成，主要在哺乳动物的生殖系统中表达，如睾丸、卵巢、下丘脑、垂体、肾上腺等[1]。DAX-1 基因敲除的雄性小鼠表现为性腺机能减退、睾丸发育异常、生精障碍等[2]。已有研究证明先天性肾上腺发育不全（adrenal hypoplasia congenital, AHC）和促性腺激素分泌不足的性腺机能减退（hypogonadotropic hypogonadism, HHG）的发病与DAX-1突变有关[3]。雄激素受体（androgen receptor, AR）也是核受体家族中的一员，是一种配体依赖的反式转录调节蛋白。在细胞质内，AR与雄激素结合形成同源二聚体，进入胞核与靶基因的雄激素反应元件（ARE）结合调控下游基因表达[4]。AR 基因突变可使其丧失与雄激素的结合能力，导致男性不育或雄激素不敏感综合征[5-7]。DAX-1和AR是两个紧密相关的基因，两者均位于X染色体上，且具有相似的表达水平，它们编码的同源蛋白均有一个DNA结合区域。因此，我们推断DAX-1和AR蛋白在细胞内可能存在相互作用。本研究拟构建人DAX-1 的真核表达载体，并与雄激素受体AR共转染至COS-7细胞内，使用Co-IP技术和Western blot技术检测两者间是否存在相互作用，从而为后续研究 DAX-1功能、突变致病及DAX-1与AR的作用机制奠定基础。

材料与方法

一、材料

非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7购自美国菌种保藏中心（ATCC），人睾丸组织的RNA、高保真DNA聚合酶购自Takara公司，反转录试剂盒购自Fermentas公司，限制性内切酶购自NEB公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、柱回收试剂盒购自Omega公司，引物合成及DNA测序于上海英潍捷基贸易有限公司完成，脂质体 LipofectamineTM2000购自Invitrogen 公司，人的AR真核表达载体由美国乔治惠普癌症研究中心张传祥教授惠赠,哺乳动物蛋白提取试剂盒购自Qiagene公司，AR的抗体购自Abcam公司，HA的抗体购自sigma公司，ProteinA/G珠子购自Millipore公司，DMEM 培养液、胎牛血清（FBS）购自美国 Gibco 公司，培养皿、培养板、移液管等耗材均购于Corning公司。

二、方法

（一）人DAX-1基因cDNA编码区全长序列的获取

根据 Gene bank 中 DAX-1 的序列用 Prime premier 5.0 软件设计引物。DAX-1 引物序列∶上游5， CCCAAGCTTATGGCGGGCGAGAAC 3，下游5，CGCGGATCCCGTATCTTTGTACAG 3，分别在上游和下游引物的5，端加上HindⅢ和BamH1酶切位点。将人睾丸组织RNA逆转录合成cDNA，方法参照Fermentas反转录试剂盒说明书。以cDNA为模板进行PCR反应，1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物大小。

（二）DAX-1真核表达载体的构建

用胶回收试剂盒回收扩增的PCR产物，用HindⅢ-HF和BamH1-HF分别双酶切PCR产物和带HA多肽标签的pcDNA3.1(+)，37℃ 4h，对酶切后的产物分别进行柱回收和胶回收，T4 DNA连接酶连接回收后产物，连接体系： pcDNA3.1(+)-3' HA为2μl；回收的DNA片段为6μl；T4 Ligase为1μl；10× Ligation Buffer为1μl，16℃ 8h，取连接产物5ul加入到50ulDH5a感受态细胞中，置于冰上30min，42℃热击45s，冰上放置2min，加入600μl不含抗生素的LB培养液，37℃摇床培养60min，取200μl涂板(含100μg/mL氨苄青霉素的培养板)，放37℃培养过夜。挑克隆进行菌液PCR验证，取阳性克隆送测序。

（三）细胞培养与转染

用含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养COS-7细胞，放置于37℃、5%CO2的培养箱中，按照无菌操作台内的常规细胞培养方法培养。将处于对数生长期的COS-7 细胞以 3×105/孔密度接种于6孔培养板，待第2天细胞贴壁后，根据转染试剂LipofectamineTM 2000的转染步骤，将重组质粒pcDNA3.1(+)-3' HA-DAX1（实验组，2μg）和pcDNA3.1(+)-3，HA空载（对照组，2μg）与hAR的表达载体（2μg）分别共转染到COS-7细胞。

（四）细胞总蛋白的提取

转染48 h后吸弃培养基，根据Qiagene公司的哺乳动物蛋白提取试剂盒的提取步骤用1×PBS溶液洗涤2次，加入1ml预冷的PBS用细胞刮轻轻刮下，转移到1.5ml的Ep管，450×g，4℃离心5min，弃掉上清置于冰上，用100μl Lysis Buffer（含0.1U Benzonase Nuclease,1μl 100×Protease Inhibitor）重悬沉淀，4℃旋转5min后，14 000×g，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管中。

（五）免疫共沉淀

将实验组与对照组提取的蛋白平均分成4分，其中一份作为Input样品，加入6.25μl的 5×SDS Loading Buffer（含5%1 mM DTT），混匀后98℃处理10 min，-80℃保存。余下3份上清液均加入475μl的Lysis Buffer，补充至每管总体积为500μl，之后分别加入2μg AR抗体，2μg HA抗体，2ug IgG；4℃旋转1h；每管加入20μl ProteinA/G，4℃旋转过夜。12 000×g，4℃瞬时离心20s，弃上清；加入600μl Lysis Buffer重悬，12 000×g，4℃离心1min；洗涤Beads，共洗涤3次，弃上清；向Beads中加入15μl的Lysis Buffer和等体积2XSDS上样缓冲液，混匀后98℃处理10 m in。制备SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量15μl，常规电泳、转膜、封闭，加入一抗（鼠抗人HA 和兔抗人AR单克隆抗体，1∶2000稀释），4℃过夜孵育及相应的二抗（1∶10000稀释）室温孵育1 h, ECL 发光液处理后暗室内曝光胶片，于室温下自然风干，扫描仪扫描结果保存。

结 果

一、PPCCRR法获得DDAAXX--11基因

利用PCR法，成功获取了约1413 bp的目的片段（图1）。

图1 DAX-1基因的PCR扩增结果

二、重组载体的鉴定

1%琼脂糖凝胶电泳酶切结果（图2）显示，近1413bp处的条带为酶切后的目的片段，测序结果也显示该片段为DAX1编码基因，表明pcDNA3.1(+)-3，HA-DAX1构建成功。实验重复3次，结果均一致。

图2 重组质粒pcDNA3.1(+)-3，HA-DAX1双酶切结果

三、蛋白质CCoo--IIPP及Western BBlloott检测结果

COS-7细胞中分别共转入hAR和pcDNA3.1(+)-3，H A-D A X 1表达质粒（实验组）以及h A R和pcDNA3.1(+)-3，HA空载（对照组），转染48 h后收集细胞提取总蛋白，做anti-AR和anti-HA的Co-IP以及anti-AR和anti-HA的Western Blot检测蛋白的相互作用和表达情况，结果显示DAX-1和AR蛋白在细胞内可能存在相互作用（图3）。

图3 Co-IP及Western Blot检测细胞内DAX-1和AR的相互作用

讨 论

全球约有10%～15%的育龄夫妇面临不能生育的问题，其中一半是由于男性不育。男性不育发病因素具有复杂性和多样性的特点，包括疾病，营养不良，内分泌紊乱，基因缺陷和环境因素等[8]，其具体发病机制尚不明确，但从家族病例报道和小鼠模型的研究成果中可以推断遗传因素起了很大作用[9]。据估计，大约有2 000个不同的基因与男性生育有关[10]。大多数基因突变可使青春期发育受损，随后由于下丘脑-垂体对性腺或其基因有重要促进作用的因子缺乏，最终引起男性不育。DAX-1和AR即是属于下丘脑-垂体-性腺轴上的两个基因，两者均位于X染色体上，凡影响功能的基因突变均可引起表型的变化。据报道，DAX-1和AR是在男性人群中检测到的自然突变率最高的两个基因[11]。我们推测，DAX-1与AR蛋白在细胞内可能存在相互作用。

人类DAX-1基因位于X染色体p21，于1994年克隆成功[12]。该基因编码的蛋白由470个氨基酸组成，是核受体家族的成员，DAX-1蛋白作为一种转录因子对垂体促性腺细胞和肾上腺皮质的发育起非常重要的作用。已有研究证明AHC和 HHG的发病与DAX-1突变有关[3]。由于DAX-1 基因位于Xp上的DSS区，当该区双拷贝时常伴有46，XY男性的性反转（女性化），所以起初DAX-1被认为是卵巢决定基因。但是，随后的条件敲除研究结果表明它在调节精子发生中起重要作用，敲除后的雄性小鼠表现为性腺机能减退、睾丸发育异常、生精障碍等[2]。AR是迄今研究最多的与男性不育有关的基因之一，在哺乳动物精子生成中发挥着重要作用。其编码的蛋白含有氨基端的DNA结合域和碳端的雄激素结合域。46，XY男性由于AR突变可引起完全性雄激素不敏感综合征(CAIS),表现为女性的原发性闭经[5-7]。AR敲除的小鼠同样表现出雄激素不敏感及睾丸下降不全症状，这类小鼠生精受阻,精原细胞大量死亡导致不育，且该症状不能被雄激素药物补救[13]。

本研究结果显示DAX-1和AR蛋白在细胞内可以相互作用，由于两者在男性生殖系统中均有举足轻重的地位，由此我们推测，DAX-1与AR蛋白相互作用的改变可能在男性不育的发生过程中至关重要，DAX-1或AR基因突变可能会影响两者的相互作用，进而影响下游的靶基因，其具体分子机制有待深入研究。

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（2013-12-09收稿）

Study on interaction between DAX-1 and AR protein＊

Yang Lihua, Li Yuchi, Wang Xuliang, Shi Min, Jiang Zhimao, Gui Yaoting**
Laboratory of Male Reproductive Medicine，Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, China

ObjectiveDAX-1 and AR play irreplaceable roles in male reproductive system, and show some relationship between them. This study is mainly to validate the interaction between DAX-1 and AR protein.MethodsDAX-1 eukaryotic expression vector with HA peptide tag were constructed. The recombined plasmid was sequenced and cotransfected into COS-7 cells by lipofectamineTM2000 with the eukaryotic expression vector of AR. After 48 hours, cells were collected and total protein was extracted.Co-Immunoprecipitation technique was used to detect the interaction between DAX-1 and AR protein.RessuullttssThe eukaryotic expression vector of human DAX1 was constructed successfully. The interaction between DAX-1 and AR was validated by Co-Immunoprecipitation.ConcluussiioonnDAX-1 may interact with AR protein. This study might lay the foundation for further study of DAX-1 function, mutation and the molecular mechanism of its interaction with AR.

∶ Gui Yaoting, E-mail∶ guiyaoting2007@aliyun.com; Tel∶ 0755-83923333-3320

R 697

资助∶ 深圳市科创委项目（编号：CXB201104220045A），深圳市科技计划项目（编号：201202001，201003076）

**通讯作者, E-mail∶ guiyaoting2007@aliyun.com; Tel∶ 0755-83923333-3320

ddooii∶10.3969/j.issn.1008-0848.2014.02.002