杨奇盛 赵 剡 周贤龙 倪绍洲 沈 俊 王 翔 潘正启 宋小兵

武汉大学中南医院急救中心（武汉 430071）

大鼠睾丸扭转/复位引发CCDD44++TT细胞亚群失衡对生殖细胞凋亡的影响*

杨奇盛 赵 剡 周贤龙 倪绍洲 沈 俊 王 翔 潘正启 宋小兵

武汉大学中南医院急救中心（武汉 430071）

目的探讨在大鼠睾丸扭转/复位过程中CD4+T细胞亚群Th1/Th2失衡对生殖细胞凋亡的影响。方法SD雄性成年大鼠30只，随机分成假手术组、睾丸扭转组和复位组，每组10只。通过建立左侧睾丸扭转和扭转复位动物模型，在手术后24h分别取材，血清酶联免疫法（ELISA）检测血清干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素12（IL-12）、白细胞介素4（IL-4）和白细胞介素10（IL-10）水平；原位缺口末端标记法（TUNEL法）检测各组左侧睾丸生殖细胞凋亡指数。结果与假手术组相比，扭转组和扭转复位组与Th1细胞相关的细胞因子IFN-γ、IL-12水平升高明显（P＜0.05），Th2细胞相关的细胞因子IL-4和IL-10水平下降（P＜0.05）；生殖细胞凋亡指数增加。结论在大鼠睾丸扭转和复位过程中CD4+T细胞亚群偏移与生殖细胞凋亡存在相关性。

T淋巴细胞亚群; 精索扭转; 再灌注损伤; 细胞凋亡

Key woorrddssT-Lymphocyte Subsets; Spermatic Cord torsion; reperfusion injury; Apoptosis

睾丸扭转是临床常见的急症，多发生于25岁前的青少年，必须紧急外科手术复位恢复睾丸血供[1]。在睾丸扭转及复位过程中缺血再灌注损伤是临床上常见的病理生理现象，是多因素参与的复杂病理过程，涉及到多个环节，其中免疫反应是造成睾丸生精功能损害作用机制之一。CD4+T淋巴细胞是机体主要免疫调节细胞，主要有Th1和Th2两种亚群[2]。本研究通过建立大鼠睾丸扭转/复位动物模型，检测血浆CD4+T细胞亚群相关因子变化及睾丸组织生殖细胞凋亡，探讨CD4+T细胞亚群失衡变化趋势。

材料和方法

一、实验动物分组及动物模型的制作

健康成年SD雄性大鼠（SPF级，购自武汉大学医学院动物实验中心）30只，随机分为假手术组（A组）、睾丸扭转组（B组）和复位组（C组），每组10只。

睾丸扭转动物模型建立方法[3]：乙醚吸入麻醉，常规消毒，下腹部正中小切口，显露左侧睾丸并切断睾丸引带，分离筋膜至附睾头，顺时针旋转左侧睾丸720°固定于腹壁并缝合伤口。睾丸扭转复位动物模型建立方法：顺时针旋转左侧睾丸720°并维持2h期间夹闭伤口，2h后将扭转睾丸复位固定于阴囊。

A组SD大鼠乙醚吸入麻醉后，下腹部正中小切口，显露左侧睾丸后缝合，术后饲养24h取材；B组左侧睾丸扭转，术后饲养24h取材；C组左侧睾丸扭转后复位，术后饲养24h取材。

二、实验方法

（一）血清酶联免疫法（ELISA）检测

各组大鼠抽取颈静脉血液，室温静置2h，3000r/ min离心15min后取上清，-20℃保存备用。ELISA法检测各组血浆中干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素12（IL-12）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素10（IL-10）的浓度（按试剂盒说明书操作）。

（二）睾丸生殖细胞凋亡检测

取各组大鼠左侧睾丸组织，4%多聚甲醛固定睾丸组织后制作石蜡切片，检测生殖细胞凋亡。采用原位缺口末端标记法（TUNEL法）检测睾丸生殖细胞凋亡情况。凋亡细胞核呈棕黄色，阴性对照不加末端转化酶。凋亡指数（AI）计算：每张切片随机选取100个生精小管横切面(×400），计数凋亡细胞，求得平均每生精小管横切面凋亡细胞数。

三、统计学分析

结 果

一、EELLIISSAA检测结果

各组ELISA检测结果中，CD4+T细胞亚型Th1分泌的细胞因子IFN-γB组和C组分别与假A组比较，血清浓度升高，差异有统计学意义（P＜0.05），其中C组较B组升高明显（P＜0.05）。与促Th1细胞分泌细胞因子IFN-γ相关的IL-12在B组和C组血浆中均升高，与A组比较升高差异有统计学意义（P＜0.05），其中C组较B组升高明显（P＜0.05），其变化与IFN-γ呈正相关。Th2细胞分泌的细胞因子IL-4、IL-10在B组和C组血清浓度均较A组降低，差异有统计学意义（P＜0.05），其中IL-10在C组血清浓度与B组血清浓度比较降低明显。然而IL-4在B组血清浓度高于C组血清浓度（P＜0.05），见表1。

表1 3组大鼠血清检测结果及扭转睾丸组织凋亡指数比较

二、生殖细胞凋亡检测

各组均取左侧睾丸组织行TUNLE检测，发生凋亡的细胞核被染成棕黄色。A组凋亡细胞较少，B组和C组左侧睾丸组织凋亡生殖细胞明显增多。B组和C组生殖细胞凋亡指数显著高于A组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

图1 各组大鼠左侧睾丸生殖细胞凋亡程度比较

讨 论

睾丸扭转造成睾丸组织缺血，对睾丸生精上皮及间质均造成不同程度的损害，导致睾丸生殖细胞凋亡，同时全身或睾丸局部在抗原递呈细胞（antigen presenting cells）辅助作用下使淋巴细胞抗原产生免疫应答反应[4]。初始的CD4+T细胞按照细胞因子分泌模式和生物学功能主要分为Th1细胞和Th2 细胞亚群。Th1/Th2细胞亚群间处于相对平衡的状态，但当机体发生损伤时， Th1/Th2 之间的平衡状态被打破，分泌不同的细胞因子，启动机体的免疫反应，进而造成疾病的产生和发展[5]。

在睾丸扭转过程中，生殖细胞损害程度主要取决于扭转程度和扭转持续的时间，这两个方面决定着睾丸的缺血程度。随着扭转时间的延长，睾丸生精功能的受损程度逐步加重[6]。睾丸扭转后的病理学损害表现为：睾丸组织充血水肿，生精上皮变薄，生精上皮细胞排列紊乱，细胞层次及数量减少。初级精母细胞内可见染色质浓缩和边聚，形态异常，部分圆形精子细胞和初级精母细胞从生精上皮脱落入生精小管。睾丸扭转远期结果则可出现睾丸萎缩，生精停滞。随着扭转时间的延长，间质细胞和支持细胞也逐渐受到影响[7]。睾丸扭转对睾丸的损伤主要包括生精上皮细胞凋亡，间质细胞萎缩，精子生成减少且形态异常，以及支持细胞的病理改变。

组织缺血再灌注机制尚未完全阐明，但目前认为它是多因素参与下的损伤性级联反应。睾丸缺血再灌注时在局部血管内皮细胞受损后引起Th1细胞分泌细胞因子干扰素γ、肿瘤坏死因子-β 和IL-2等介导的细胞免疫，通过增强巨噬细胞组织相关抗原Ⅱ分子的表达，促进巨噬细胞对抗原的递呈和自身活化，加重组织的免疫炎性反应，进一步加重睾丸组织的损害，甚至出现全身炎症反应综合征[8]。IL-12可以促使CD4+T淋巴细胞由初始的Th0分化为Th1细胞，促Th1细胞分泌干扰素γ增加，强化Th1细胞免疫应答[9]。在此损害同时存在Th2细胞分泌的细胞因子IL-4、IL-10和IL-13等通过B细胞介导的体液免疫，促B细胞产生抗体保护机体免受炎性损伤，保护睾丸组织减轻免疫病理损害。同时，Th2细胞因子IL-4能抑制巨噬细胞的活性，阻断干扰素-γ活化巨噬细胞后的效应，因此能减缓有巨噬细胞介导的免疫应答[10]。

本实验证实在睾丸扭转缺血再灌注过程中，CD4+T淋巴细胞由Th0分化为Th1细胞亚型增多，并促Th1细胞分泌干扰素γ增加的IL-12升高明显，与Th1细胞亚型分泌细胞因子干扰素γ成正相关。Th2细胞亚型分泌的细胞因子在缺血再灌注过程中分泌减少，IL-4在缺血阶段分泌较再灌注时分泌增加，这可能与在损伤过程中Th2细胞分泌IL-4抑制Th1细胞分泌干扰素γ作用有关。在睾丸缺血再灌注病理过程中，患侧睾丸生殖细胞凋亡明显。

在睾丸缺血再灌注过程中，CD4+T淋巴细胞亚群之间的平衡发生偏移，Th1细胞亚型介导的细胞免疫占主导作用，其分泌细胞因子增多，Th2细胞亚型分泌受到抑制，这与生殖细胞凋亡存在正相关性。

1 Yazawa H, Sasagawa I, Suzuki Y, et al. Glucocorticoid hormone can suppress apoptosis of rat testicular germ cell induced by testicular ischemia. Fertil Steril 2001; 75(5)∶ 980-985

2 Annunziato F, Romagnani S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Res Ther 2009; 11(6)∶257

3 Turner TT, Tung KS, Tomomasa H, et al. Acute testicular ischemia results in germ cell-specifi c apoptosis in the rat. Biol Reprod 1997; 57(6)∶ 1267-1274

4 Raeburn CD, Sheppard F, Barsness KA, et al. Cytokines for surgeons. Am J Surg 2002; 183(3)∶ 268-273

5 O’Garra A, Arai N. The molecular basis of T helper 1 and T helper 2 cell differentiation. Trends Cell Biol 2000; 10(12)∶ 542-550

6 Sukhotnik I, Miselevich I, LurieM, et al. The time relation-ship between ipsilateral testicular ischemia and germ cell apoptosis in the contralateral testis. Pediatr Surg Int 2005; 21 (7)∶ 512-516

7 Turner TT, Bang HJ, Lysiak JL. The molecular pathology of experimental testicular torsion suggests adjunct therapy to surgical repair. J Urol 2004; 172(6 Pt 2)∶2574-2578

8 Hwang SS, Kim YU, Lee W, et al. Differential Expression of Nuclear Receptors in T Helper Cells. J Microbiol Biotechnol 2009; 19(2)∶ 208-214

9 Kaplan MH, Sun YL, Hoey T, et al. Impaired IL-12 responses and enhanced development of Th2 cells in Stat4-defi cient mice. Nature 1996; 382(6587)∶ 174-177

10 Burne-Taney MJ, Yokota-Ikeda N, Rabb H. Effects of combined T- and B-cell defi ciency on murine ischemia reperfusion injury. Am J Transplant 2005; 5(6)∶ 1186-1193

（2013-08-01收稿）

Effects of unbalance CD4+T cell subgroups on germ cell apoptosis during rat testicular torsion＊

Yang Qisheng, Zhao Yang, Zhou Xianlong, Ni Shaozhou, Shen Jun,Wang Xiang, Pan Zhengqi, Song Xiaobing
Department of Emergency ,Zhongnan Hospital of Wuhan University,Wuhan 430071,China

ObjectiveeTo investigate the effects of the unbalance of CD4+T cell subgroups on germ cell apoptosis during rat testicular torsion.MetthhooddssMale SD rats were randomly divided into three groups and there were 10 rats in each group. For rats in sham operation group, they served as the control; For rats in left unilateral testicular torsion group, their left testes were rotated 720 degree for 2 hours; For rats in left testicular torsion reset group, their testes were reseted after 2 hours testicular torsion. At 24 hours after operation, levels of serum cytokines IFN-γ, IL-12, IL-4 and IL-10 were measured by ELISA. Germ cell apoptosis index in left testes of the rats was determined by TUNEL.RessuullttssCompared with that of the sham operation group, the levels of Th1 type cytokines were signifi cantly increased in torsion and detorsion groups(P＜0.05). The levels of Th2 type cytokines such as IL-4, IL-10 were obviously lower in torsion and detorsion groups than that in sham operation group (P＜0.05). CD4+T cell subgroups was unbalance during testicular torsion in rats. The apoptosis index of germ cells was signifi cantly higher in torsion and detorsion groups than that of sham operation group.ConcluussiioonnCD4+T cell subgroups is unbalance in ischemia reperfusion injury in rat testis, which may be associated with germ cell apoptosis.

R 697.2

资助∶ 湖北省自然科学基金（项目号2011CHB026）

ddooii∶10.3969/j.issn.1008-0848.2014.02.003