吴彩艳，邹秀娟，戚南山，廖申权，李 娟，温列娜，吕敏娜，孙铭飞＊

（1.广东省农业科学院动物卫生研究所，广东广州510640；2.广东天农食品有限公司，广东清远511827）

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默菌（Riemerella anatipestifer，RA）所引起的对养鸭业危害最严重的细菌性疾病之一［1］。目前，对于该病的防治主要是疫苗免疫与药物治疗相结合的方法。由于RA的血清型有21个，且各型之间几乎无交叉保护［2］，致使研制保护多种血清型的疫苗存在困难，因此药物仍是防控本病的主要方法。由于抗菌药物的广泛及不合理使用，RA的耐药性越来越严重［3-4］。而新药研发速度缓慢，因此必须对现有药物合理配伍使用以延缓其耐药性。根据药理学的研究，有些药物合用可以增强抑菌效果。本研究所使用的阿莫西林和舒巴坦就具有协同作用，其中阿莫西林是广谱青霉素类，长期使用会产生耐药性（主要是因为β-内酰胺酶易被水解），而舒巴坦本身只有微弱的抗菌活性，但具有强大的广谱β-内酰胺酶抑制作用，可保护阿莫西林免遭β-内酰胺酶水解而降低抗菌活性，两者合用具有良好的协同作用，抗菌谱扩大且抗菌作用增强［5］，对耐药菌的作用也显示了与敏感菌同等的效力。本研究测定了阿莫西林单一药物及阿莫西林和舒巴坦复合剂对阿莫西林敏感和耐药的RA的最低抑菌浓度（MIC），检测复合剂的抑菌状况及确定最佳配比。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料样本 病料采自广东省肇庆和阳江2个规模化鸭场的3周龄商品鸭，鸭场发病率均在70%以上。病鸭临床症状主要表现下痢、头颈震颤、共济失调，病理变化主要为典型的纤维素性肝周炎、心包炎、气囊炎等。各场分别采集10只病鸭或濒死鸭，无菌采集其脑、肝脏和心脏等病料。

1.1.2 培养基和试剂 改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB，含50mL/L小牛血清）、胰酶大豆琼脂培养基（TSA，含50mL/L小牛血清）、麦康凯培养基、按细菌学常规方法配制；微量生化发酵管，为广东环凯微生物科技有限公司产品；药敏纸片，为杭州微生物试剂有限公司产品；药物种类包括阿莫西林、恩诺沙星、头孢噻吩、利福平、氨苄青霉素、头孢曲松钠、多黏菌素B、氧氟沙星、氟苯尼考、痢特灵、庆大霉素、头孢噻肟、复方新诺明。阿莫西林粉剂（药物有效力70%），为山西恒丰强药业产品；舒巴坦粉剂，为山东久隆精细化工有限公司产品；RA定型血清，由广东省农科院动物卫生研究所寄生生物研究室保存的RA1-6和8、10型标准菌株，并以这些参考菌株免疫兔子制备。

1.1.3 试验用动物 1日龄商品代樱桃谷肉鸭50只，由广州郊区某鸭场提供，未接种任何疫苗和抗血清。饲养于无RA污染的环境中。

1.1.4 菌液的制备 将分离株进行纯培养，挑取单个菌落接种于TSB培养基，37℃培养18h，利用平板表面散步法进行菌落计数，然后用生理盐水将菌液稀释成2×108cfu/mL备用。

1.2 方法

1.2.1 病原的分离与鉴定

1.2.1.1 病原的分离 无菌方法取上述病死鸭的肝脏、心脏和脑，划线接种于TSA平板和麦康凯琼脂平板，于37℃烛缸中培养24h，挑取单个可疑菌落进行纯培养。

1.2.1.2 涂片染色镜检 挑取纯培养的单菌落进行革兰染色和瑞特染色，镜检，观察细菌的形态和染色特性。

1.2.1.3 生化试验 将上述分离菌的纯培养物分别接种于各种微量生化发酵管，于37℃温箱中培养24h后观察并记录结果。

1.2.1.4 PCR鉴别诊断方法 按文献［6］报道方法，将上述分离菌株的纯培养物用种特异性PCR方法进行分子鉴定。

1.2.1.5 动物接种试验 将上述分离的纯培养物经病原学检查、形态学检查、分子生物学诊断鉴定为RA的菌株接种于TSB培养基。以无菌生理盐水将RA稀释成1×108cfu/mL的细菌悬液，肌肉注射7d雏鸭，1mL/只，每组10只，同时设生理盐水对照组，隔离饲养，观察致病力。

1.2.2 血清型鉴定 按文献［5］报道的方法对分离株进行血清型鉴定。

1.2.3 药敏试验 按标准纸片法进行，即用灭菌棉拭子沾取菌液，在TSA平板上均匀涂布，待平板面稍干，用灭菌镊子将上述药敏纸片平放在板上，然后将平板于37℃培养18h～24h，测量并记录各分离株抑菌圈的直径。

1.2.4 最低抑菌浓度的测定（MIC） 以试管两倍稀释法［7］略加改动测定最低抑菌浓度，取带盖的灭菌试管10支为一列，每只试管添加TSB 1mL，于第1支试管中添加0.4mL的待测药物，混匀后取出1mL加入第2支试管，以后以此类推至第8支试管，混匀后吸取1mL弃掉，第9支试管为不加药物的阳性对照，向以上第1支试管～第9支试管中各加入1mL稀释的菌液，第10支试管为不加药物和菌液只加生理盐水的的阴性对照。用此方法评价阿莫西林及阿莫西林（AMC）/舒巴坦（SBT）不同配比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）对临床分离的ZQ株和 YJ株的体外抗菌活性。根据预试验的结果，针对RA（ZQ株）配置阿莫西林与舒巴坦贮存液浓度均为1 280μg/mL。分两列进行，第1列，第1支试管～第8支试管药物终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1μg/mL，第2列，第1支试管～第8支试管药物终浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.03、0.015、0.072 5、0.003μg/mL；针对 RA（YJ株）配置阿莫西林与舒巴坦贮存液浓度均为12 800μg/mL，第1支试管～第8支试管药物终浓度分别为1 280、640、320、160、80、40、20、10μg/mL。

2 结果

2.1 细菌的分离与鉴定

2.1.1 培养特性 2个分离株在TSA平板上均生长光滑、湿润、半透明的奶油状菌落，而麦康凯平板无细菌生长。

2.1.2 生化试验 2个分离株均不发酵蔗糖、乳糖、木糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇；不产生硫化氢，不利用柠檬酸盐；甲基红试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验阴性；氧化酶、过氧化物酶试验阳性。

2.1.3 PCR反应结果 通过特异性PCR扩增，2个分离株均扩增到300bp大小的条带，与目的条带大小一致（图1）。

图1 分离株PCR鉴定结果Fig.1 Identification results of isolates by PCR

2.1.4 动物接种试验 2个分离株对雏鸭均有不同程度的致病力，接种后3d剖检可见典型的鸭传染性浆膜炎的病理变化，发病率100%，致死率分别为70%和80%。

根据上述试验结果，确定从2个鸭场共分离鉴定到2株RA，分别命名为ZQ株和YJ株。

2.2 血清型鉴定结果

根据玻片凝集试验结果确定2株RA均为血清1型。

2.3 药敏试验结果

RA（ZQ株）对阿莫西林、头孢噻吩、利福平、氨苄青霉素、头孢曲松钠、头孢噻肟敏感，对多黏菌素B、氧氟沙星、氟苯尼考、痢特灵、庆大霉素、复方新诺明和恩诺沙星耐药；RA（YJ株）对氟苯尼考、多黏菌素B、氨苄青霉素、氧氟沙星、痢特灵敏感，对阿莫西林、恩诺沙星、头孢噻吩、利福平、头孢曲松钠、庆大霉素、头孢噻肟和复方新诺明耐药。

2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定

阳性对照管有细菌生长，阴性对照管无细菌生长，澄清透明，说明对照成立。阿莫西林单一作用对其敏感的ZQ株 MIC值为0.5μg/mL，而复合剂AMC/SBT 1∶1配 比 的 MIC值 为0.007 25μg/mL，2 ∶ 1 配 比 的 MIC 值 为0.062 5μg/mL，4 ∶ 1 配 比 的 MIC 值 为0.25μg/mL，为3∶1配比的2倍。阿莫西林单一作用对其耐药的YJ株MIC值为640μg/mL，复合剂 AMC/SBT 1∶1、2∶1配比的 MIC值均为20μg/mL，而4∶1配比的 MIC值为80μg/mL，为3∶1配比的2倍（表1）。

可见，阿莫西林与舒巴坦复合剂对RA分离株体外抗菌活性优于阿莫西林单独作用，表现出明显的体外协同作用，对敏感的ZQ株，协同作用可以进一步缩小MIC值；对耐药的YJ株，协同作用可以减少耐药性的产生，使抗性药物继续发挥疗效。另外，考虑到临床用药成本，既保证药物效果又可降低舒巴坦的用量，建议临床用药以AMC/SBT 2∶1配比为最佳。

表1 MIC测定结果Table 1 The result of MIC determination

3 讨论

鸭疫里默菌与其他细菌一样，由于药物的长期使用甚至滥用，导致耐药性问题异常突出，甚至到了无药可用的地步。吴彩艳等［8］曾对广东地区86株RA进行药敏试验，其中77.91%～82.55%的菌株对阿莫西林、头孢噻吩、氨苄青霉素、氟苯尼考敏感，但大多数菌株对其他9种常用抗菌药物具有明显抗性，并具有多重耐药倾向。谢永福等［9］对来自珠三角地区87株RA进行耐药性分析，显示大多数菌株对常用抗生素类药物具有较强的耐药性。吴华等［10］根据临床实践经验，认为由于大量抗生素和抗菌药物用于治疗鸭传染性浆膜炎，造成RA耐药现象日益严重，交叉耐药状况明显。

究竟细菌的耐药性是如何产生的，刘佳丽等［11］将细菌的耐药机制分为自发性基因突变和耐药基因掺入，细菌耐药基因不仅由其染色体携带，还常由染色体外的质粒、转座子和整合子携带，通过融合、转导和转化在不同种属的遗传物质之间转移或聚集重排造成多重耐药菌发生率大幅上升。Hu Q H等［12］发现，RA中的生物膜对抗生素和去污剂有很好的抵抗作用，认为生物膜的产生是造成RA持续感染的重要因素。

本研究突破了以往将疾病的防控寄希望于新药的研制上，而是在原有药物的基础上进行重新利用，既节约了研发成本又节省了新药上市的时间。通过阿莫西林与舒巴坦的协同作用，增强了阿莫西林的抗菌活性，恢复了耐药菌株对阿莫西林的敏感性。原因是舒巴坦能迅速贯穿细菌细胞壁并不可逆地破坏β-内酰胺酶，抑制剂清除后也不能使酶的活性得到恢复，并且这种抑制作用随着时间的延长而增强，从而使细菌恢复对阿莫西林的敏感性。受此启发，在当前RA耐药性严重的情况下，熟练运用药物的协同作用，将为临床上防控鸭传染性浆膜炎带来良好效果。

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［4］Chen Y P，Tsao M Y，Lee S H，et al.Prevalence and molecular characterization of chloramphenicol resistance in Riemerella anatipestifer isolated from ducks and geese in Taiwan［J］.Avian Pathol，2010，39：333-338.

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