姚东璧，李复煌，谢三磊，李桂萍，徐福州，房慧伶，孙惠玲＊

（1．北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京畜禽疫病防控技术北京市重点实验室，北京100097；2．广西大学

动物科学技术学院，广西南宁530004；3．北京市畜牧兽医总站，北京100107；4．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070）

副鸡禽杆菌3个血清型参考菌株生长曲线的测定和比较

姚东璧1，2，李复煌3，谢三磊4，李桂萍1，徐福州1，房慧伶2，孙惠玲1＊

（1．北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京畜禽疫病防控技术北京市重点实验室，北京100097；2．广西大学

动物科学技术学院，广西南宁530004；3．北京市畜牧兽医总站，北京100107；4．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070）

为探索副鸡禽杆菌生长特性，比较不同血清型菌株生长特性的差异，采用分光光度法和菌落计数法分别测定副鸡禽杆菌血清A型（221株）、血清B型（0222株）、血清C型（Modesto株）3个参考菌株的生长曲线，对两种方法测定的生长曲线进行比较。结果表明，两种方法绘制的生长曲线差异较大，对数生长期和稳定期菌液OD 600 nm值与活菌数对数之间呈现一元二次多项式回归关系。另外，3个血清型菌株的生长稳定期都比较短暂，各型菌株达到生长高峰的时间和活菌数都有差异。该试验为副鸡禽杆菌生物学特性的比较研究及疫苗的研制奠定了基础。

副鸡禽杆菌；生长曲线；生长特性

副鸡禽杆菌（Avibacteriumparagallinarum）原称副鸡嗜血杆菌（Haemophilusparagallinarum），是一种无芽胞的革兰阴性杆菌，兼性厌氧，于固体培养基接种培养时需要5%～10%的CO2环境，最适生长温度为37℃，单个菌落在45°光照下呈蓝色透明状，但随着体外传代次数的增加，菌落色泽将减弱或消失。该菌在体外培养的生长要求苛刻，需要NAD（辅酶Ⅰ）的参与，但不是所有菌型都需要，南非和墨西哥对NAD非依赖性菌株已有报道［1－2］。

该菌是鸡传染性鼻炎的病原菌，主要引起鸡的上呼吸道疾病，表现为鸡的生长停滞和蛋鸡产蛋率下降，且呈世界性分布，可导致严重的经济损失。最常用的Page分型法将副鸡禽杆菌分为A、B、C 3个血清型，Kume法将Av．paragallinarum分为3个血清群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群分别相当于Page A型、C型和B型。我国分离株多为A型和B型，C型只有一例报道［3］。该病发生后的治愈率高，但易复发，目前主要采取多价灭活疫苗来控制其发生和传播。

细菌生长曲线的绘制方法主要有分光光度法和菌落计数法两种。分光光度法是通过测定菌液的OD 600 nm值，得出的是菌液中包含的总菌数，该方法的优点是操作简便。菌落计数法得出的是菌液中的活菌数，相对来说要准确得多，但是操作复杂而且耗时、耗力。对于一些细菌两种方法绘制的生长曲线有很好的相关性［4－6］。本研究的目的是在同样的条件下培养3个不同血清型副鸡禽杆菌参考菌株，采用分光光度法和活菌计数法测定菌株的生长曲线，了解其生长特性并比较菌株之间的差异，另外，通过试验评价是否可以用分光光度法的OD 600 nm值来衡量菌液中的活菌数量，为副鸡禽杆菌的生物特性比较研究和疫苗生产提供参考依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌株 副鸡禽杆菌A、B、C 3个血清型参考菌株，A型（221株）、B（0222株）和 C（Modesto株）由澳大利亚昆士兰州动物研究所Blackall博士惠赠。

1．1．2 培养基 TSA 固体培养基（含0．025 g／L NAD和100 m L／L鸡血清）；TSB液体培养基（含0．025 g／L NAD和100 m L／L鸡血清）。

1．2 方法

1．2．1 合成引物和PCR扩增 根据文献［7］合成扩增副鸡禽杆菌500 bp基因片段的引物序列，对培养的细菌进行PCR检测，判断培养物是否为副鸡禽杆菌。上游引物为：5′－TGA GGG TAG TCT TGC ACG CGA AT －3′，下 游 引 物 为：5′－CAA GGT ATC GAT CGT CTC TCT ACT －3′。反应体 系为：2×buffer 12．5μL，Taq（5 U／μL）0．5μL，d NTP（2．5 mmol／L）2μL，N1（10μmol／L）1μL，R1（10μmol／L）1μL，样品4μL，灭菌去离子水4μL，总体积为25μL。PCR反应条件为：94℃5 min；94℃45 s，56℃45 s，72℃1 min，进行30个循环；72℃10 min，4℃结束反应。

1．2．2 细菌培养 将800 m L／L甘油保存的菌种复苏，无菌接种于TSA培养基，于37℃、5%的CO2培养箱中培养24 h～30 h。经PCR验证后挑取单个菌落转接至5 m L TSB液体培养基，于37℃摇振培养12 h，再按1∶60体积比例转接至100 m L TSB中扩大培养，于180 r／min 37℃摇振培养24 h。

1．2．3 菌液OD 600 nm值测定和活菌计数 每隔1 h～2 h在无菌条件下收获少量菌液，用于测量OD 600 nm值，并用灭菌生理盐水进行梯度稀释后各取3个稀释度的菌液50μL涂布TSA平板，于37℃、5%的CO2培养箱中培养至48 h，然后进行菌落计数，根据稀释倍数和平板上的菌落数来计算活菌数（cfu／m L）。

1．2．4 菌液纯检 收获菌液的同时取少量菌液进行普通营养琼脂平板划线培养，于37℃培养48 h，观察有无杂菌长出，以判定菌液在培养期间是否被污染。

2 结果

2．1 菌液的特异性与纯度检验结果

经纯检，48 h后普通营养琼脂平板表面无细菌长出，表明细菌培养过程中无污染；菌落PCR检测在500 bp处出现了清晰的电泳条带（图1），表明本试验培养的3个菌株皆为副鸡禽杆菌。

图1 副鸡禽杆菌A、B、C 3个血清型参考菌株的PCR检测结果Fig．1 PCR detection results of three reference strains of Avibacteriumparagallinarum serotype A，B and C

2．2 分光光度法和菌落计数法绘制副鸡禽杆菌A、B、C 3个血清型参考菌株的生长曲线

采用菌液OD 600 nm值和活菌计数值（cfu／m L）的对数为纵坐标分别绘制3个血清型参考菌株的生长曲线（图2，图3）。图2是以菌液OD 600 nm值为纵坐标绘制的生长曲线，3个血清型参考菌株生长规律基本一致，即在监测之初5 h即进入了对数生长期，13 h达到稳定期，持续到14 h后OD 600 nm值开始急剧下降进入衰退期，15 h以后OD 600 nm值开始下降得比较缓慢。如图2所示，3个血清型菌株的生长稳定期都很短。

图3是以活菌计数值（cfu／m L）的对数为纵坐标绘制的生长曲线，3个血清型参考菌株在监测之初5 h即进入了对数生长期，C型菌株达到生长高峰的时间最短，为10 h，但是C型达到生长高峰时的活菌数却最少，为15亿；其次是A型，培养11 h达到活菌数高峰，为31．6亿；B型培养至12 h达到活菌数高峰，为43亿。3个血清型菌株达到生长高峰后的1 h内，A型和C型活菌数衰减大约2／3，B型活菌数衰减了14倍。因为在菌株生长高峰时段采用了1 h的监测频率，因此，3个血清型菌株的生长稳定期都短于1 h。

图2 副鸡禽杆菌A、B、C 3个血清型参考菌株的生长曲线（分光光度法）Fig．2 Growth curves of of three reference strains of Avibacterium paragallinarum serotype A，B and C （spectrophotometry method）

图3 副鸡禽杆菌A、B、C 3个血清型参考菌株的生长曲线（活菌计数法）Fig．3 Growth curves of of three reference strains of Avibacterium paragallinarum serotype A，B and C （colony count method）

2．3 3个血清型参考菌株在对数生长期和稳定期OD 600 nm值和活菌数之间的函数关系

由图2和图3可看出，分光光度法和菌落计数法的生长曲线差异较大，当菌液OD 600 nm值达到最高值时活菌数已不是最多，二者之间不呈线性相关。取3个血清型菌株对数生长期至稳定期的数据，以OD 600 nm值为横坐标，菌液中活菌数对数为纵坐标，绘制两者的回归曲线，结果为一元二次多项式回归，见图4、图5和图6。3个血清型参考菌株的回归方程分别为y＝－25．60x2＋34．75x－1．789，相关指数 R2＝0．913（A 型）；y＝－42．90x2＋50．04x－4．513，相关指数R2＝0．995（B型）；y＝－23．03x2＋30．31x－0．715，相关指数 R2＝0．936（C型）。3个血清型回归方程的拟合度都比较高，其中，以B型回归方程估测的可靠程度最高，其次是C型和A型。

图4 A型参考菌株OD 600 nm值与活菌数对数之间的函数关系图Fig．4 Relationship between OD 600 nm value and log10 cfu／m L of reference strain of Avibacteriumparagallinarum serotype A

图5 B型参考菌株OD 600 nm值与活菌数对数之间的函数关系图Fig．5 Relationship between OD 600 nm value and log10 cfu／m L of reference strain of Avibacteriumparagallinarum serotype B

图6 C型参考菌株OD 600 nm值与活菌数对数之间的函数关系图Fig．6 Relationship between OD 600 nm value and log10 cfu／m L of reference strain of Avibacteriumparagallinarum serotype C

3 讨论

细菌的生长曲线反映了细菌在培养过程中生长、繁殖和衰亡的规律，在适宜条件下培养，会出现延滞期、对数生长期、稳定期和衰退期4个阶段。在研究细菌的各种特性时，生长曲线有助于选择到生长状态比较一致的细菌，一般选择刚开始进入平台期的细菌。因此，在进行细菌生物特性比较研究之前，找到细菌的稳定期，对于试验结果的可靠性有着重要的意义。

本试验比较了3个不同血清型副鸡禽杆菌参考菌株在体外培养条件下的生长曲线，采用分光光度法和活菌计数法两种方法，两种方法获得的生长曲线差异较大，不能用菌液OD 600 nm值来直接衡量活菌数的多少。在对数生长期和稳定期，菌液OD 600 nm值和活菌数之间不呈现线性关系，而是呈现比较复杂的一元二次多项式回归关系，这一特性与其他菌的相关报道不一致［4－6］。这与菌种本身的特性有关，因为副鸡禽杆菌是一种非常敏感的细菌，对外界温度及理化因素的抵抗力均较弱，在固体培养基上的菌落，4℃下存放超过5 d～7 d，就不再有存活的细菌。在适宜液体培养基中，常温下衰亡的速度也很快，反复冻融会大大降低菌液中的活菌数。

另外，副鸡禽杆菌在体外培养的生长要求苛刻，大多数菌株需要还原型辅酶A，即使如此，本菌的生长和繁殖能力也无法和其他禽类的致病菌相比，3个血清型菌株达到生长高峰时的活菌数只能与静置培养的大肠埃希菌［8］、鸭疫里默菌活菌数相当，只有摇振培养的鸭疫里默菌活菌数的1／10［9］。而且，该菌的生长稳定期非常短暂，因此，在培养副鸡禽杆菌进行灭活疫苗生产时，一定要把握好收获菌液的时间。

本试验结果不但为进一步菌株生物学特性比较奠定了基础，而且为今后的副鸡禽杆菌毒力比较试验及疫苗的研制奠定了基础。

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Determination and Comparative Analysis of Growth Curves of Three Reference Strains ofAvibacteriumparagallinarumSerotype A，B and C

YAO Dong－bi1，2，LI Fu－huang3，XIE San－lei4，LI Gui－ping1，XU Fu－zhou1，FANG Hui－ling2，SUN Hui－ling1
（1．BeijingKeyLaboratoryforPreventionandControlofInfectiousDiseasesinLivestockandPoultry，InstituteofAnimal HusbandryandVeterinaryMedicineofBeijingAcademyofAgricultureandForestrySciences，Beijing，100097，China；
2．CollegeofAnimalScienceandTechnology，GuangxiUniversity，Nanning，Guangxi，530004，China；
3．BeijingGeneralStationofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine，Beijing，100107，China；
4．FacultyofVeterinaryMedicine，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou，Gansu，730070，China）

To explore and compare the growth changes and growth characteristics of different serotype ofAvibacteriumparagallinarum，growth curves of three reference strains of serotype A （221 strain），B（0222 strain）and C （Modesto strain）were determined by spectrophotometry and colony count methods under the same culture conditions．Then two methods were compared．Results showed that the growth curves made by two methods were different．OD 600 nm and the logarithm of colony count in logarithmic phases and stationary phase showed a quadratic polynomial regression．In addition，stationary phases of three serotypes were short and differences were observed on reaching the growth peak and viable colony counts in three serotypes．This experiment laid a foundation for the further comparative study on the biological characteristics and vaccine development ofAvibacteriumparagallinarum．

Avibacteriumparagallinarum；growth curve；growth characteristic

S852．613

A

1007－5038（2014）07－0043－04

2013－12－26

国家自然科学基金项目（30871867）；北京市新世纪百千万人才工程项目

姚东璧（1988－），女，广西人，硕士研究生，主要从事细菌分子生物学与免疫学研究。＊通讯作者