刘 方，赵玄多，安 贝，刘 慧，高 洋，张立强，贾芸晓，陈德坤

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

羊口疮病毒凤翔株ORFV121和vIL－10基因的生物信息学分析

刘 方，赵玄多，安 贝，刘 慧，高 洋，张立强，贾芸晓，陈德坤＊

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

为分析羊口疮病毒ORFV121和vIL－10基因在凤翔（FX0910）强毒株（v ORFV）和弱毒株（lvORFV）之间的差异，应用PCR方法扩增羊口疮病毒ORFV121和vIL－10基因的全长序列并测序，应用生物信息学软件分析基因的核酸、氨基酸相似性，蛋白的亲水性、二级结构以及抗原性。结果显示，lv ORFV的ORFV121基因118位的谷氨酸缺失，说明该处发生的碱基突变为有意突变，该突变导致弱毒株相应蛋白的亲水性、二级结构发生变化，蛋白的抗原性在很多区域发生本质改变；vIL－10在蛋白质水平出现了5个氨基酸位点突变（14：V→W，49：A→P，57：T→M，72：R→C，102：I→V）和79位插入1个色氨酸。这些位点差异导致蛋白的亲水性、二级结构和抗原性发生了变化。ORFV121基因和vIL－10基因在v ORFV和lv ORFV之间存在差异，这些基因差异导致蛋白的亲水性、二级结构和抗原性发生改变。

羊口疮病毒凤翔株；ORFV121；vIL－10；基因差异

羊口疮（Orf）又称羊传染性脓疱皮炎（Contagious pustular dermatitis），是由羊口疮病毒（Orf virus，ORFV）引起的一种急性、接触性、嗜上皮性人兽共患传染病［1］。主要感染绵羊和山羊，绵羊比山羊更易感，羔羊和小羊比成年羊更易感［2］。该病在成年羊中表现为高发病率（90%）和低病死率（＜10%）［3］，在羔羊和小羊中表现为高发病率和高死亡率，发病率可达100%，病死率可达93%［4］，对养羊业造成巨大的经济损失。研究人员发现了更多的羊口疮病毒地方株，但这些毒株之间存在不同程度的基因差异［5－8］，并有报道指出不同毒株间不能产生良好的免疫保护［9］。而我国现有的羊口疮疫苗为20世纪90年代甘肃畜牧兽医研究所研制的羊口疮弱毒疫苗，该疫苗现在已经不能对羊口疮起到良好的预防作用。

随着养羊业的发展，羊口疮已成为影响养羊业的主要疾病之一［10－11］，亟需要一种免疫保护率高的羊口疮疫苗。因此，需要对羊口疮强、弱毒株间基因进行生物信息学分析，预测强、弱毒株间基因结构及功能的差异，找出与病毒毒力和免疫保护功能相关的基因，为利用分子生物学技术对羊口疮病毒进行基因改造，制备免疫保护率高的疫苗提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 病毒、载体和宿主细胞 原核克隆载体p GEM－Teasy为Promega公司产品；羊口疮病毒凤翔株强毒株（virulent ORFV－FX0910，vORFV）和弱毒株（low virulent ORFV－FX0910，lv ORFV）、感受态细胞HD－5α，由西北农林科技大学动物医学院免疫学实验室保存。

1．1．2 主要试剂 rTaqDNA ploymerase、T4 DNA连接酶、DNA标准DL 2 000为宝生物工程（大连）有限公司产品；Trans DNA MarkerⅠ为北京全式金生物技术有限公司产品；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1．2 方法

1．2．1 引物设计与合成 根据GenBank上已经提交的羊口疮病毒ORFV121、vIL－10基因序列，用Primer Premier 5．0设计2对引物，预计扩增片段为440 bp和912 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1．2．2 ORFV121、vIL－10基因PCR扩增 取本实验室保存的v ORFV和lvORFV细胞培养液100μL，在沸水中煮沸5 min，冰水冷却3 min，1 000 r／min离心5 min，取上清为PCR扩增模板。PCR反应程序如下：94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s，共35个循环；最后72℃10 min。取PCR产物用20 g／L琼脂糖凝胶电泳检测，然后按照DNA胶回收试剂盒说名书回收PCR产物。

1．2．3 ORFV121、vIL－10基因克隆、测序 将胶回收产物与p GEM－Teasy链接，转化到DH5α感受态细胞中，从含有氨苄青霉素的平板中挑取单克隆用于质粒PCR鉴定，阳性克隆送南京金斯瑞生物技术有限公司测序。

1．2．4 生物信息学分析 测序结果用DNA Star软件整理后用Blast检测序列是否正确，用Clone Manager进行核酸相似性和氨基酸相似性分析，DMA Man分析蛋白亲水性和二级结构，DNA Star分析抗原性分析。

2 结果

2．1 ORFV121、vIL－10基因PCR扩增

分别用引物扩增vORFV和lvORFV的OFFV121和vIL－10基因，扩增后ORFV121基因在900 bp、vIL－10基因在450 bp左右各有一条特异性条带，与ORFV121基因的片段大小912 bp和vIL－10基因的片段大小440 bp基本相符（图1）。

图1 PCR扩增vIL－10和ORFV121基因Fig．1 PCR amplication of vIL－10 and ORFV121 genes

2．2 基因克隆、鉴定

挑取单克隆，过夜培养提取质粒，以重组质粒为模板进行PCR扩增，获得与目的片段大小相符的特异性条带，证明该质粒中含有欲克隆基因（图2）。将测序结果用DNA Star处理后进行Blast比对分析，比对结果显示克隆基因与设计一致，表明成功克隆了ORFV－FX0910强、弱毒株的ORFV121基因和vIL－10基因。

图2 p GEM－T easy－vIL－10和p GEM－T easy－ORFV121重组质粒PCR鉴定Fig．2 PCR identification of recombinant pGEM－T easy－vIL－10 and p GEM－T easy－ORFV121

2．3 ORFV121、vIL－10基因的核酸相似性和氨基酸相似性分析

用Clone Mnager分析ORFV121和vIL－10基因的核酸相似性和氨基酸相似性。结果表明，v ORFV中存在一个氨基酸位点差异，即118位的谷氨酸缺失（图3）。强、弱毒株间vIL－10基因在蛋白质水平存在6个氨基酸位点差异，具体见表2、图4。

表2 vIL－10基因突变情况Table 2 Gene mutation of vIL－10

图3 ORFV－FX0910强、弱毒株间ORFV121基因核酸相似性和氨基酸相似性分析Fig．3 Similarity analysis of gene and amino acid of ORFV121 between vORFV and lvORFV

图4 ORFV－FX0910强、弱毒株间vIL－10基因核酸相似性和氨基酸相似性分析Fig．4 Similarity analyses of nucleic acids and amino acids of vIL－10 gene between vORFV and lvORFV

2．4 ORFV121、vIL－10蛋白亲水性分析

经DNA Man软件分析，ORFV121蛋白大部分区域为亲水性结构，vIL－10蛋白大部分区域为疏水性结构。与强毒株相比，弱毒株中ORFV121蛋白由于118位谷氨酸缺失，其后的氨基酸亲水性发生相对变化。对于vIL－10，由于弱毒株中存在6个氨基酸突变位点，蛋白的亲水性发生很大变化，特别是70位～80位氨基酸这段区域，蛋白的亲水性发生了本质改变（图5）。

图5 强、弱毒株间ORFV121、vIL－10蛋白亲水性分析Fig．5 The analyes of hydophilicity for ORFV121 and vIL－10 between vORFV and lvORFV

2．5 ORFV121、vIL－10蛋白二级结构分析

用DNA Man预测ORFV121和vIL－10蛋白的二级结构。ORFV121的二级结构预测结果显示lv ORFV 118位氨基酸附近的螺旋结构消失，有可能突变为卷曲结构。vIL－10二级结构预测结果显示，弱毒株中存在较多的二级结构位点差异，特别是36位～72位氨基酸间二级结构差异最多，其中57位氨基酸附近的折叠结构消失，可能突变为卷曲结构。110位的折叠结构突变为卷曲结构，但该位点没有碱基突变，说明碱基突变导致蛋白其他部位的二级结构也发生了本质变化（图6）。

2．6 ORFV121、vIL－10蛋白抗原性分析

用DNA Star中的Protean预测ORFV121和vIL－10蛋白的抗原性。ORFV121蛋白的抗原性分析表明，vORFV中绝大部分区域抗原指数很高，但lv ORFV中只有少部分区域抗原指数较高，说明lvORFV中ORFV121蛋白的抗原性较差。强、弱毒株间vIL－10蛋白绝大部分的抗原指数相同，只有部分区域的抗原指数发生了变化，说明强、弱毒株间vIL－10蛋白的抗原性未发生太大变化（图7）。

3 讨论

本研究所用lv ORFV已通过动物安全性试验证明其毒力已经人工致弱，不具有致病性，不会导致动物产生临床病变。动物免疫试验证明该弱毒株免疫保护效果好，保护率可达90%［12］。

ORFV121通过编码一种特异性病毒NF－κB信号通路抑制物，能够结合NF－κB p65并抑制 NF－κB p65的磷酸化和核转运，抑制NF－κB信号通路，从而抑制细胞凋亡［13－14］。在 ORFV121基因突变或者缺失的情况下，细胞凋亡抑制作用减弱或消失，病毒感染宿主后，可迅速被机体识别和清除。本实验室的前期研究发现，野毒株感染的羊群会长期带毒，但是用lvORFV免疫羊群后，其带毒时间不会超过2个月。说明羊口疮病毒凋亡抑制作用的减退可能与ORFV121基因118位谷氨酸缺失有关。

羊口疮病毒编码的vIL－10具有免疫抑制作用，能够抑制巨噬细胞和角蛋白细胞分泌TNF－α和IL－8及活化的淋巴细胞分泌IFN－γ［15］。lv ORFV 中vIL－10基因发生突变和缺失，可能导致vIL－10的免疫抑制作用减轻或者消失，感染羊群后，宿主的抗感染免疫被迅速激发，病毒被快速清除。也有研究指出ORFV毒力致弱可能与vIL－10 87位的氨基酸突变有关［15］，但本研究中87位的氨基酸未发生突变，说明ORFV－FX0910毒力弱化与87为氨基酸是否突变关系不大。

图6 ORFV－FX0910强、弱毒株中ORFV121和vIL－10蛋白的二级结构分析Fig．6 Analyses of secondary structure of ORFV121 and vIL－10 proteins between vORFV and lvORFV

图7 vORFV和lvORFV之间ORFV121和vIL－10抗原性分析Fig．7 Antigenic analyses for ORFV121 and vIL－10 of ORFV－FX0910 between virulent and low virulwnt strains

本研究通过克隆vORFV和lvORFV中的ORFV121基因和vIL－10基因的全长，并对其进行生物信息学分析，分析表明v ORFV和lvORFV之间ORFV121基因和vIL－10基因存在差异，这些基因差异导致蛋白的亲水性、二级结构和抗原性发生改变。这些研究结果为利用分子生物学技术对羊口疮病毒进行基因改造，制备免疫保护率高的疫苗提供理论依据。

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Bioinformatics Analyses ORFV121 Gene and vIL－10 Gene of ORFV－FX0910 Strain

LIU Fang，ZHANO Xuan－duo，AN Bei，LIU Hui，GAO Yang，ZHANG Li－qiang，JIA Yun－xiao，CHEN De－kun

（CollegeofVeterinaryMedicine，NorthwestA＆FUniversity，Yangling，Shaanxi，712100，China）

Abstruct：In order to analyse the diffenences in ORFV121 gene and vIL－10 gene between the virulent and low virulent strains of ORFV－FX0910．The full lengths of the two genes were abtained by the method of PCR amplification and then for sequencing．The similarities of nucleic acids，amino acids，hydrophilicities，secondary structures，and antigenicities of proteins were analyzed using bioinformatics software．The results showes that，there was a glutamic deletion at site 118 of ORFV121 in the lvORFV，which suggested the corresponding base mutation was significant．As a result，hydrophilicity and secondary structure were changed，and antigenicity was changed essentially at many domains of the ORFV121 protein．For vIL－10 protein，there were 5 amino acid mutations（14：V→W，49：A→P，57：T→M，72：R→C，102：I→V）and one tryptophan insertion at site 79，which resulting in the variations of hydrophilicity，secondary structure，and antigenicity．In conclusion，there were differnences in ORFV121 gene and vIL－10 gene between v ORFV and lv ORFV，and the hydrophilicities，secondary structures，and antigenicities of proteins were changed due to these mutations．

ORFV－FX0910；ORFV121；vIL－10；genetic variation

S852．659．1

A

1007－5038（2014）07－0052－07

2014－03－27

陕西省科技统筹新工程计划项目（2013KTZB02－02－02，2013KTZB02－02－03）

刘 方（1987－），女，陕西渭南人，硕士研究生，主要从事分子病原学与免疫学研究。＊通讯作者